Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:58 Page 174
12. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
Bogumi³a Makuch
12.1. WPROWADZENIE
Proces chromatograficznego rozdzielania mo¿e byæ wykonany równie¿, gdy faza
stacjonarna jest w postaci cienkiej warstwy. Tak realizowan¹ chromatografiê cieczow¹ nazwa siê
chromatografi¹ planarn¹ lub cienkowarstwow¹ (ang.
Thin Layer Chromatography
- TLC). Gdy
faza stacjonarna jest warstw¹ bibu³y, jest to chromatografia bibu³owa, natomiast, gdy jest
rozprowadzona jako warstwa na p³ytce szklanej, ewentualnie aluminiowej lub z tworzywa
sztucznego, nazywamy j¹ chromatografi¹ cienkowarstwow¹.
Po raz pierwszy chromatografiê cieczow¹ cienkowarstwow¹ zastosowano w 1938 roku do
oznaczania zanieczyszczeñ leków i od tego czasu do dnia dzisiejszego jest to metoda powszech-
nie stosowana praktycznie we wszystkich rodzajach laboratoriów (farmaceutyczne, kliniczne i
inne). Metoda ta sta³a siê szczególnie popularna od 1956 roku, gdy do przygotowania cienkich
warstw chromatograficznych na p³ytkach szklanych zastosowano proste urz¹dzenie. Od twórcy
tego urz¹dzenia nazywane powlekaczem Stahla. Stahl by³ równie¿ twórc¹ podstaw teorety-
cznych i metodycznych chromatografii cienkowarstwowej.
Chromatografia cienkowarstwowa pod wzglêdem eksperymentalnym jest niezwyk³¹ tech-
nik¹, gdy¿ mo¿e byæ wykonywana w "warunkach domowych", albo jak to bywa obecnie - mo¿e
byæ w pe³ni zinstrumentalizowana.
Burzliwy rozwój wysokosprawnej chromatografii kolumnowej w latach siedemdziesi¹-
tych zmniejszy³ zainteresowanie technik¹ cienkowarstwow¹, szczególnie z powodu braku mo¿li-
woœci rejestracji i przechowywania wyników rozdzielania. O ponownym wzroœcie zainteresowa-
nia t¹ technik¹ w ostatnich latach zadecydowa³o zwiêkszenie jej mo¿liwoœci rozdzielczych, dziê-
ki wprowadzeniu tzw. wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (ang.
High Perfor-
mance Thin Layer Chromatography
- HPTLC).
Nowoczesna wyskosprawna chromatografia cienkowarstwowa i wysokosprawna elucyjna
chromatografia kolumnowa to metody komplementarne, w których podstaw¹ rozdzielania jest
podzia³ rozdzielanych sk³adników pomiêdzy dwie fazy tj., stacjonarn¹ (sta³¹ albo ciek³¹) i ciek³¹
- ruchom¹. Ró¿nice dotycz¹ g³ównie przestrzennego u³o¿enia fazy stacjonarnej i kinetyki proce-
su rozdzielania.
Podstawowe zalety chromatografii cienkowarstwowej to mo¿liwoœæ przechowywania
p³ytek z rozdzielonymi substancjami a tak¿e mo¿liwoœæ obserwacji stopnia rozdzielania na
ka¿dym jego etapie i przerwanie procesu w dowolnym czasie jak równie¿ detekcja w ka¿dym
etapie rozwijania chromatogramu. W przypadku kolumny chromatograficznej, mo¿na dokonaæ
detekcji i oceniæ stopieñ rozdzielenia dopiero po opuszczeniu kolumny przez sk³adniki
rozdzielanej mieszaniny.
Postêp w rozwoju chromatografii cienkowarstwowej wi¹¿e siê z wprowadzeniem
mniejszych ziaren (podobnie jak w kolumnowej), dostêpnoœci¹ gotowych warstw chro-
matograficznych oraz z instrumentalizacj¹ metody. Ogromnym postêpem w rozwoju tej techniki
174
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:58 Page 175
Chromatografia cienkowarstwowa
Tabela 12.1. Porównanie konwencjonalnej (TLC) i wysokosprawnej (HTLC) chromatografii
cienkowarstwowej.
Parametr
Technika konwencjonalna Technika wysokosprawna
Wielkoœæ p³ytki cm
20x20
10x10
Gruboœæ warstwy, µm
100- 250
200
Przeciêtna wielkoœæ ziaren, µm
20
5-15
Rozk³ad œrednicy ziaren, dp
10- 60
w¹ski
Objêtoœæ próbki, µl
1-5
0,1-0,2
Œrednica plamki, mm
w chwili startu
po rozwiniêciu
3-6
8-15
1,0-1,5
2 - 6
Droga rozwijania, cm
10-15
3 - 6
Czas rozwijania, min
30-200
3 - 6
Granice wykrywalnoœci
absorpcja œwiat³a, ng
fluorescencja, pg
1-5
50-100
0,1-0,5
5-10
by³o wprowadzenie detektorów, zwanych densytometrami, urz¹dzeñ do automatycznego
dozowania próbki oraz komputerowego opracowania wyników.
Porównanie techniki konwencjonalnej i wysokosprawnej chromatografii cienkowarst-
wowej przedstawiono w tabeli 12.1.
Jak widaæ, w przypadku HPTLC granica oznaczalnoœci jest znacznie ni¿sza, a sprawnoœæ
wy¿sza. Miar¹ tego jest œrednica pasma stê¿eniowego (plamki). Sprawnoœæ konwencjonalnej
warstwy chromatograficznej wynosi oko³o 600 pó³ek, natomiast warstw wysokosprawnych
oko³o 6000. Ze wzglêdu na czêste stosowanie chromatografii cienkowarstwowej, jako metody
kontrolnej wielu procesów istotny jest znacznie krótszy czas rozwijania chromatogramu, ni¿ w
przypadku stosowania chromatografii kolumnowej.
12.2. ZASADA PROCESU ROZDZIELANIA
Mechanizm rozdzielania mieszaniny metod¹ chromatografii cienkowarstowej jest analo-
giczny jak w do wysokosprawnej chromatografii kolumnowej. Jednak, warunki procesu s¹
trudne do jednoznacznej definicji i kontroli eksperymentalnej. Wynika to z obecnoœci par roz-
puszczalnika i ich kontaktu z warstw¹ fazy stacjonarnej.
W wielkim uproszczeniu, zjawiska zachodz¹ce w komorze, mo¿na przedstawiæ nastêpuj¹-
co: faza ruchoma dziêki si³om kapilarnym migruje wzd³u¿ warstwy sorbentu (fazy stacjonarnej)
i w zale¿noœci od energii oddzia³ywañ substancji z fazami wykazuj¹ one ró¿ny stopieñ retencji,
tzn. maj¹ ró¿n¹ drogê migracji i znajduj¹ siê w ró¿nych miejscach warstwy.
Such¹ p³ytkê chromatograficzn¹ umieszcza siê w komorze chromatograficznej, w której
znajduj¹ siê rozpuszczalnik oraz jego opary, a tak¿e pewna niewielka iloœæ pary wodnej. Sk³ad
pary, w przypadku mieszaniny rozpuszczalników zazwyczaj nie odpowiada sk³adowi fazy
ruchomej, a prê¿noœæ cz¹stkowa sk³adników pary ulega zmianie w trakcie procesu rozwijania
chromatogramu. Sk³ad par mo¿e byæ równie¿ niepowtarzalny w kolejnych eksperymentach, gdy¿
jest zale¿ny od objêtoœci komory chromatograficznej, stanu nasycenia atmosfery komory par¹
przed rozpoczêciem procesu rozwijania i oczywiœcie, od temperatury.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
175
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 176
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.1.
a - schematyczny obraz procesów zachodz¹cych w czasie rozwijania chromatogramu na p³ytce chro-
matograficznej w warunkach konwencjonalnej chromatografii cienkowarstwowej.
b - przekrój komory typu sandwich,
c - obraz chromatogramu gdy zachodzi demiksja fazy ruchomej oraz kszta³t plamki eluowanej w stre-
fie demiksji.
Z wy¿ej wymienionych powodów szczególne znaczenie ma dba³oœæ o powtarzalnoœæ
warunków rozwijania chromatogramu.
Schemat zachodz¹cych procesów przedstawiono na rysunku 12.1a. Pary rozpuszczalnika
(obecne w komorze w zwiêkszonej iloœci, dziêki wy³ozeniu jej wnêtrza bibu³¹ zanurzon¹ w elu-
encie), adsorbuj¹/desorbuj¹ siê na powierzchni suchej warstwy fazy stacjonarnej, jak równie¿,
penetruj¹ wilgotn¹ czêœæ sorbentu. W takich warunkach trudno jest osi¹gn¹æ stabilny stan
równowagi. Opisan¹ powy¿ej niestabilnoœæ mo¿na znacznie ograniczyæ (nie wyeliminowaæ)
przez stosowanie komór typu sandwich, w których przestrzeñ nad warstw¹ jest maksymalnie
ograni-czona (patrz rysunek 12.1b). Podobny efekt osi¹ga siê stosuj¹c tzw. chromatografiê
ciœnieniow¹ (ang.
Over Pressued lub Pressurized Thin Layer Chromatography
- OPTLC).
Warunki rozwijania chromatogramu w komór sandwich i w warunkach OPTLC s¹
zbli¿one do warunków w kolumnie chromatograficznej.
Innym parametrem, który nie wystêpuje w kolumnie chromatograficznej, a prawie zawsze
ma miejsce na cienkiej warstwie to gradient sk³adu fazy ruchomej w czasie jej migracji. Zjawisko
to jest szczególnie widoczne, gdy faz¹ ruchom¹ jest mieszanina rozpuszczalników znacznie
ró¿ni¹cych siê w³aœciwoœciami, jak np. si³¹ elucyjn¹, prê¿noœci¹ par, temperatur¹ wrzenia, lep-
koœci¹ i inne. W skrajnych przypadkach mo¿e nawet nastêpowaæ rozdzielenie siê (demiksja)
sk³adników fazy ruchomej, która migruje wzd³u¿ warstwy. W wyniku tego w ka¿dym miejscu
warstwy chromatograficznej s¹ inne warunki rozdzielania. Przyk³adowy obraz zjawiska demik-
sji przedstawiono na rysunku 12.1c.
Parametrem stosowanym do opisu zjawisk zachodz¹cych w warstwie chromatograficznej,
jest wspó³czynnik
R
F,
definiowany jako stosunek drogi przebytej przez œrodek plamy (pasma
stê¿eniowego) substancji (a) do drogi czo³a fazy ruchomej (b), patrz rysunek 12.2.
R
=
a
(1)
F
b
R
= =
+ +
t
m
1
(2)
F
t t
1
k
ms
t
s
,
t
m
- czas przebywania plamki substancji w fazie stacjonarnej i w fazie
ruchomej,
k
- wspó³czynnik retencji.
176
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 177
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.2. Chromatogram cienkowarstowy mieszaniny substancji.
Nale¿y podkreœliæ, ¿e oznaczanie wspó³czynnika
R
F
z równania 2 jest trudne i nieprakty-
czne z powodu dynamicznego przebiegu procesu rozdzielania.
W praktyce laboratoryjnej powszechnie jest stosowany wspó³czynnik
R
F
obliczony z rów-
nania 1. WartoϾ
R
F
mo¿e zmieniaæ siê od 0 do 1, gdy
R
F
= 0 to chromatografowane substancje
w stosowanym uk³adzie chromatograficznym zbyt silnie oddzia³ywuj¹ z faz¹ stacjonarn¹, nato-
miast, nie ma oddzia³ywañ z faz¹ ruchom¹ i praktycznie nie znajduj¹ w siê w fazie ruchomej.
Natomiast, gdy
R
F
= 1 to substancje praktycznie wêdruj¹ z czo³em rozpuszczalnika i ma miejsce
brak oddzia³ywañ z faz¹ stacjonarn¹. Optymalna wartoœæ wspó³czynnika
R
F
powinna byæ w
przedziale 0, 2 - 0,8. Oznacza to, ¿e warunki chromatograficzne s¹ najbardziej stabilne. Wartoœæ
wspó³czynnika
R
F,
podobnie jak innych parametrów retencji, zale¿y od rodzaju analitu, fazy
ruchomej i fazy stacjonarnej. Wyniki rozdzielania metod¹ chromatografii cienkowarstwowej,
podobnie, jak w kolumnie chromatograficznej, zale¿¹ nie tylko od ró¿nic w wartoœciach
wspó³czynników
R
F
, ale równie¿ od rozmycia plam (pasm stê¿eniowych) wywo³anego dyfuzj¹ i
dyspersj¹ cz¹steczek substancji w fazie ruchomej i stacjonarnej, a zatem, zale¿¹ od sprawnoœci
uk³adu, czyli liczby pó³ek teoretycznych lub wysokoœci równowa¿nej pó³ce teoretycznej
(WRTP albo ang. HETP).
Podobnie, jak dla kolumny, liczbê pó³ek teoretycznych (
n)
mo¿na obliczyæ z równania
podanego poni¿ej:
a
2
( )
2
⋅
n
= =
16
F
(3)
b
2
w
2
s
gdzie:
w
s
- œrednica plamki substancji, pozosta³e parametry jak w równaniu 1.
Poniewa¿ prêdkoœæ fazy ruchomej jest ró¿na w ka¿dym miejscu warstwy chro-
matograficznej, to, równie¿ sprawnoœæ jest ró¿na. Na rysunku 12.3 przedstawiono zmiany
wysokoœci pó³ki teoretycznej w funkcji odleg³oœci migracji.
W klasycznej chromatografii cienkowarstwowej (TLC), migracja fazy ruchomej wzd³u¿
warstwy jest zale¿na od si³ kapilarnych, zatem prêdkoœæ fazy ruchomej jest malej¹c¹ funkcj¹
odleg³oœci miêdzy czo³em rozpuszczalnika i poziomem cieczy w komorze chromatograficznej.
Ponadto si³y kapilarne s¹ zbyt ma³e, aby zapewniæ prêdkoœæ, przy której by³aby najmniejsza
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
177
Rb
16
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 178
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.3. Zmiany œredniej wysokoœci pó³ki teoretycznej (
h
) w funkcji odleg³oœci migracji (
b
f
):
A-p³ytka wysokosprawna, rozwijanie konwencjonalne, B- p³ytka konwencjonalna , rozwijanie kon-
wencjonalne, C- p³ytka konwencjonalna, rozwijanie wysokociœnieniowe, D- p³ytka wysokosprawna,
rozwijanie wysokociœnieniowe.
Rys. 12.4. Zmiana rozdzielczoœci (
R
s
) w zale¿noœci od wartoœci wspó³czynnika
R
F
.
178
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl hannaeva.xlx.pl
12. CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
Bogumi³a Makuch
12.1. WPROWADZENIE
Proces chromatograficznego rozdzielania mo¿e byæ wykonany równie¿, gdy faza
stacjonarna jest w postaci cienkiej warstwy. Tak realizowan¹ chromatografiê cieczow¹ nazwa siê
chromatografi¹ planarn¹ lub cienkowarstwow¹ (ang.
Thin Layer Chromatography
- TLC). Gdy
faza stacjonarna jest warstw¹ bibu³y, jest to chromatografia bibu³owa, natomiast, gdy jest
rozprowadzona jako warstwa na p³ytce szklanej, ewentualnie aluminiowej lub z tworzywa
sztucznego, nazywamy j¹ chromatografi¹ cienkowarstwow¹.
Po raz pierwszy chromatografiê cieczow¹ cienkowarstwow¹ zastosowano w 1938 roku do
oznaczania zanieczyszczeñ leków i od tego czasu do dnia dzisiejszego jest to metoda powszech-
nie stosowana praktycznie we wszystkich rodzajach laboratoriów (farmaceutyczne, kliniczne i
inne). Metoda ta sta³a siê szczególnie popularna od 1956 roku, gdy do przygotowania cienkich
warstw chromatograficznych na p³ytkach szklanych zastosowano proste urz¹dzenie. Od twórcy
tego urz¹dzenia nazywane powlekaczem Stahla. Stahl by³ równie¿ twórc¹ podstaw teorety-
cznych i metodycznych chromatografii cienkowarstwowej.
Chromatografia cienkowarstwowa pod wzglêdem eksperymentalnym jest niezwyk³¹ tech-
nik¹, gdy¿ mo¿e byæ wykonywana w "warunkach domowych", albo jak to bywa obecnie - mo¿e
byæ w pe³ni zinstrumentalizowana.
Burzliwy rozwój wysokosprawnej chromatografii kolumnowej w latach siedemdziesi¹-
tych zmniejszy³ zainteresowanie technik¹ cienkowarstwow¹, szczególnie z powodu braku mo¿li-
woœci rejestracji i przechowywania wyników rozdzielania. O ponownym wzroœcie zainteresowa-
nia t¹ technik¹ w ostatnich latach zadecydowa³o zwiêkszenie jej mo¿liwoœci rozdzielczych, dziê-
ki wprowadzeniu tzw. wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (ang.
High Perfor-
mance Thin Layer Chromatography
- HPTLC).
Nowoczesna wyskosprawna chromatografia cienkowarstwowa i wysokosprawna elucyjna
chromatografia kolumnowa to metody komplementarne, w których podstaw¹ rozdzielania jest
podzia³ rozdzielanych sk³adników pomiêdzy dwie fazy tj., stacjonarn¹ (sta³¹ albo ciek³¹) i ciek³¹
- ruchom¹. Ró¿nice dotycz¹ g³ównie przestrzennego u³o¿enia fazy stacjonarnej i kinetyki proce-
su rozdzielania.
Podstawowe zalety chromatografii cienkowarstwowej to mo¿liwoœæ przechowywania
p³ytek z rozdzielonymi substancjami a tak¿e mo¿liwoœæ obserwacji stopnia rozdzielania na
ka¿dym jego etapie i przerwanie procesu w dowolnym czasie jak równie¿ detekcja w ka¿dym
etapie rozwijania chromatogramu. W przypadku kolumny chromatograficznej, mo¿na dokonaæ
detekcji i oceniæ stopieñ rozdzielenia dopiero po opuszczeniu kolumny przez sk³adniki
rozdzielanej mieszaniny.
Postêp w rozwoju chromatografii cienkowarstwowej wi¹¿e siê z wprowadzeniem
mniejszych ziaren (podobnie jak w kolumnowej), dostêpnoœci¹ gotowych warstw chro-
matograficznych oraz z instrumentalizacj¹ metody. Ogromnym postêpem w rozwoju tej techniki
174
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:58 Page 175
Chromatografia cienkowarstwowa
Tabela 12.1. Porównanie konwencjonalnej (TLC) i wysokosprawnej (HTLC) chromatografii
cienkowarstwowej.
Parametr
Technika konwencjonalna Technika wysokosprawna
Wielkoœæ p³ytki cm
20x20
10x10
Gruboœæ warstwy, µm
100- 250
200
Przeciêtna wielkoœæ ziaren, µm
20
5-15
Rozk³ad œrednicy ziaren, dp
10- 60
w¹ski
Objêtoœæ próbki, µl
1-5
0,1-0,2
Œrednica plamki, mm
w chwili startu
po rozwiniêciu
3-6
8-15
1,0-1,5
2 - 6
Droga rozwijania, cm
10-15
3 - 6
Czas rozwijania, min
30-200
3 - 6
Granice wykrywalnoœci
absorpcja œwiat³a, ng
fluorescencja, pg
1-5
50-100
0,1-0,5
5-10
by³o wprowadzenie detektorów, zwanych densytometrami, urz¹dzeñ do automatycznego
dozowania próbki oraz komputerowego opracowania wyników.
Porównanie techniki konwencjonalnej i wysokosprawnej chromatografii cienkowarst-
wowej przedstawiono w tabeli 12.1.
Jak widaæ, w przypadku HPTLC granica oznaczalnoœci jest znacznie ni¿sza, a sprawnoœæ
wy¿sza. Miar¹ tego jest œrednica pasma stê¿eniowego (plamki). Sprawnoœæ konwencjonalnej
warstwy chromatograficznej wynosi oko³o 600 pó³ek, natomiast warstw wysokosprawnych
oko³o 6000. Ze wzglêdu na czêste stosowanie chromatografii cienkowarstwowej, jako metody
kontrolnej wielu procesów istotny jest znacznie krótszy czas rozwijania chromatogramu, ni¿ w
przypadku stosowania chromatografii kolumnowej.
12.2. ZASADA PROCESU ROZDZIELANIA
Mechanizm rozdzielania mieszaniny metod¹ chromatografii cienkowarstowej jest analo-
giczny jak w do wysokosprawnej chromatografii kolumnowej. Jednak, warunki procesu s¹
trudne do jednoznacznej definicji i kontroli eksperymentalnej. Wynika to z obecnoœci par roz-
puszczalnika i ich kontaktu z warstw¹ fazy stacjonarnej.
W wielkim uproszczeniu, zjawiska zachodz¹ce w komorze, mo¿na przedstawiæ nastêpuj¹-
co: faza ruchoma dziêki si³om kapilarnym migruje wzd³u¿ warstwy sorbentu (fazy stacjonarnej)
i w zale¿noœci od energii oddzia³ywañ substancji z fazami wykazuj¹ one ró¿ny stopieñ retencji,
tzn. maj¹ ró¿n¹ drogê migracji i znajduj¹ siê w ró¿nych miejscach warstwy.
Such¹ p³ytkê chromatograficzn¹ umieszcza siê w komorze chromatograficznej, w której
znajduj¹ siê rozpuszczalnik oraz jego opary, a tak¿e pewna niewielka iloœæ pary wodnej. Sk³ad
pary, w przypadku mieszaniny rozpuszczalników zazwyczaj nie odpowiada sk³adowi fazy
ruchomej, a prê¿noœæ cz¹stkowa sk³adników pary ulega zmianie w trakcie procesu rozwijania
chromatogramu. Sk³ad par mo¿e byæ równie¿ niepowtarzalny w kolejnych eksperymentach, gdy¿
jest zale¿ny od objêtoœci komory chromatograficznej, stanu nasycenia atmosfery komory par¹
przed rozpoczêciem procesu rozwijania i oczywiœcie, od temperatury.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
175
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 176
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.1.
a - schematyczny obraz procesów zachodz¹cych w czasie rozwijania chromatogramu na p³ytce chro-
matograficznej w warunkach konwencjonalnej chromatografii cienkowarstwowej.
b - przekrój komory typu sandwich,
c - obraz chromatogramu gdy zachodzi demiksja fazy ruchomej oraz kszta³t plamki eluowanej w stre-
fie demiksji.
Z wy¿ej wymienionych powodów szczególne znaczenie ma dba³oœæ o powtarzalnoœæ
warunków rozwijania chromatogramu.
Schemat zachodz¹cych procesów przedstawiono na rysunku 12.1a. Pary rozpuszczalnika
(obecne w komorze w zwiêkszonej iloœci, dziêki wy³ozeniu jej wnêtrza bibu³¹ zanurzon¹ w elu-
encie), adsorbuj¹/desorbuj¹ siê na powierzchni suchej warstwy fazy stacjonarnej, jak równie¿,
penetruj¹ wilgotn¹ czêœæ sorbentu. W takich warunkach trudno jest osi¹gn¹æ stabilny stan
równowagi. Opisan¹ powy¿ej niestabilnoœæ mo¿na znacznie ograniczyæ (nie wyeliminowaæ)
przez stosowanie komór typu sandwich, w których przestrzeñ nad warstw¹ jest maksymalnie
ograni-czona (patrz rysunek 12.1b). Podobny efekt osi¹ga siê stosuj¹c tzw. chromatografiê
ciœnieniow¹ (ang.
Over Pressued lub Pressurized Thin Layer Chromatography
- OPTLC).
Warunki rozwijania chromatogramu w komór sandwich i w warunkach OPTLC s¹
zbli¿one do warunków w kolumnie chromatograficznej.
Innym parametrem, który nie wystêpuje w kolumnie chromatograficznej, a prawie zawsze
ma miejsce na cienkiej warstwie to gradient sk³adu fazy ruchomej w czasie jej migracji. Zjawisko
to jest szczególnie widoczne, gdy faz¹ ruchom¹ jest mieszanina rozpuszczalników znacznie
ró¿ni¹cych siê w³aœciwoœciami, jak np. si³¹ elucyjn¹, prê¿noœci¹ par, temperatur¹ wrzenia, lep-
koœci¹ i inne. W skrajnych przypadkach mo¿e nawet nastêpowaæ rozdzielenie siê (demiksja)
sk³adników fazy ruchomej, która migruje wzd³u¿ warstwy. W wyniku tego w ka¿dym miejscu
warstwy chromatograficznej s¹ inne warunki rozdzielania. Przyk³adowy obraz zjawiska demik-
sji przedstawiono na rysunku 12.1c.
Parametrem stosowanym do opisu zjawisk zachodz¹cych w warstwie chromatograficznej,
jest wspó³czynnik
R
F,
definiowany jako stosunek drogi przebytej przez œrodek plamy (pasma
stê¿eniowego) substancji (a) do drogi czo³a fazy ruchomej (b), patrz rysunek 12.2.
R
=
a
(1)
F
b
R
= =
+ +
t
m
1
(2)
F
t t
1
k
ms
t
s
,
t
m
- czas przebywania plamki substancji w fazie stacjonarnej i w fazie
ruchomej,
k
- wspó³czynnik retencji.
176
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 177
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.2. Chromatogram cienkowarstowy mieszaniny substancji.
Nale¿y podkreœliæ, ¿e oznaczanie wspó³czynnika
R
F
z równania 2 jest trudne i nieprakty-
czne z powodu dynamicznego przebiegu procesu rozdzielania.
W praktyce laboratoryjnej powszechnie jest stosowany wspó³czynnik
R
F
obliczony z rów-
nania 1. WartoϾ
R
F
mo¿e zmieniaæ siê od 0 do 1, gdy
R
F
= 0 to chromatografowane substancje
w stosowanym uk³adzie chromatograficznym zbyt silnie oddzia³ywuj¹ z faz¹ stacjonarn¹, nato-
miast, nie ma oddzia³ywañ z faz¹ ruchom¹ i praktycznie nie znajduj¹ w siê w fazie ruchomej.
Natomiast, gdy
R
F
= 1 to substancje praktycznie wêdruj¹ z czo³em rozpuszczalnika i ma miejsce
brak oddzia³ywañ z faz¹ stacjonarn¹. Optymalna wartoœæ wspó³czynnika
R
F
powinna byæ w
przedziale 0, 2 - 0,8. Oznacza to, ¿e warunki chromatograficzne s¹ najbardziej stabilne. Wartoœæ
wspó³czynnika
R
F,
podobnie jak innych parametrów retencji, zale¿y od rodzaju analitu, fazy
ruchomej i fazy stacjonarnej. Wyniki rozdzielania metod¹ chromatografii cienkowarstwowej,
podobnie, jak w kolumnie chromatograficznej, zale¿¹ nie tylko od ró¿nic w wartoœciach
wspó³czynników
R
F
, ale równie¿ od rozmycia plam (pasm stê¿eniowych) wywo³anego dyfuzj¹ i
dyspersj¹ cz¹steczek substancji w fazie ruchomej i stacjonarnej, a zatem, zale¿¹ od sprawnoœci
uk³adu, czyli liczby pó³ek teoretycznych lub wysokoœci równowa¿nej pó³ce teoretycznej
(WRTP albo ang. HETP).
Podobnie, jak dla kolumny, liczbê pó³ek teoretycznych (
n)
mo¿na obliczyæ z równania
podanego poni¿ej:
a
2
( )
2
⋅
n
= =
16
F
(3)
b
2
w
2
s
gdzie:
w
s
- œrednica plamki substancji, pozosta³e parametry jak w równaniu 1.
Poniewa¿ prêdkoœæ fazy ruchomej jest ró¿na w ka¿dym miejscu warstwy chro-
matograficznej, to, równie¿ sprawnoœæ jest ró¿na. Na rysunku 12.3 przedstawiono zmiany
wysokoœci pó³ki teoretycznej w funkcji odleg³oœci migracji.
W klasycznej chromatografii cienkowarstwowej (TLC), migracja fazy ruchomej wzd³u¿
warstwy jest zale¿na od si³ kapilarnych, zatem prêdkoœæ fazy ruchomej jest malej¹c¹ funkcj¹
odleg³oœci miêdzy czo³em rozpuszczalnika i poziomem cieczy w komorze chromatograficznej.
Ponadto si³y kapilarne s¹ zbyt ma³e, aby zapewniæ prêdkoœæ, przy której by³aby najmniejsza
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
177
Rb
16
chromatografia cienkowarstwowa.qxp 2004-06-16 23:59 Page 178
Chromatografia cienkowarstwowa
Rys. 12.3. Zmiany œredniej wysokoœci pó³ki teoretycznej (
h
) w funkcji odleg³oœci migracji (
b
f
):
A-p³ytka wysokosprawna, rozwijanie konwencjonalne, B- p³ytka konwencjonalna , rozwijanie kon-
wencjonalne, C- p³ytka konwencjonalna, rozwijanie wysokociœnieniowe, D- p³ytka wysokosprawna,
rozwijanie wysokociœnieniowe.
Rys. 12.4. Zmiana rozdzielczoœci (
R
s
) w zale¿noœci od wartoœci wspó³czynnika
R
F
.
178
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA