Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 135
9. APARATURA, KOLUMNA, SPRAWNOή ROZDZIELANIA,
PRZEPUSZCZALNOή KOLUMNY
Marian Kamiñski
9.1.
APARATURA
Najwa¿niejsi producenci chromatografów cieczowych oferuj¹ obecnie aparaty HPLC
o budowie modu³owej i o bardzo zbli¿onych zasadach konstrukcji poszczególnych modu³ów.
Ró¿nice polegaj¹ na jakoœci materia³ów i czêœci elektronicznych, a tak¿e jakoœci wykonania i
trwa³oœci. Wiêksze ró¿nice maj¹ miejsce w zakresie funkcji oprogramowania i wygody
u¿ytkowania. Istotne ró¿nice bywaj¹ w zakresie wyposa¿enia aparatu w detektory ró¿nego typu
i ró¿ne czêsto s¹ parametry u¿ytkowe oferowanych detekto-rów. Warto zwróciæ uwagê czy pro-
ducent aparatury legitymuje siê certyfikatem systemu za-pewnienia jakoœci w/g normy ISO
9001.
Najwa¿niejsze schematy ideowe (uk³ady modu³ów i elementów) chromatografu cie-
czowego:
A) Aparat typu izokratycznego (sta³y sk³ad eluentu)
Rys. 9.1. Schemat ideowy wysokosprawnego chromatografu cieczowego HPLC do zastosowañ w
warunkach elucji izokratycznej; (znaczenie symboli opisano nieco dalej)
B) Aparat typu gradientowego (programowanie zmian sk³adu eluentu albo programowanie
sta³ego sk³adu eluentu kilkusk³adnikowego).
Ró¿nica dotyczy tylko modu³ów 1 i 2. na rys. 9.1., tzn. systemu zasilania kolumny elu-
entem. Systemy zasilania kolumny wystêpuj¹ w aparatach ró¿nego typu i ró¿nej ceny w dwóch
opcjach:
a) z zastosowaniem zaworów proporcjonuj¹cych ZA do ZD (rys. 9.2) - doprowadzanie na
przemian poszczególnych sk³adników eluentu do pompy i mieszalnika w czasie okresu
proporcjonowania T (2-4 zawory proporcjonuj¹ce) po stronie ss¹cej pompy (tzw. “gra-
dient niskociœnieniowy” - opcja tañsza, lecz ma wady)
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
135
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 136
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Rys 9.2. Schemat ideowy modu³u programowania sk³adu cieczy po stronie ss¹cej pompy w aparacie
chromatograficznym (programowanie sk³adu eluentu z³o¿onego z jednego do czterech sk³adników)
b) z zastosowaniem dwóch do czterech równolegle pracuj¹cych pomp o wzajemnie
zmienianej wydajnoœci (rys. 9.3).
Rys. 9.3. Schemat ideowy zespo³u zasilania kolumny HPLC eluentem o programowanym sk³adzie z
zastosowaniem kilku równolegle pracuj¹cych pomp i mikromieszalnika 8 (tzw. "gradient wysoko-
ciœnieniowy")
Znaczenie symboli na rys. 9.1- 9.3:
1, 1', 1”, 1”' - Pojemniki z eluentem otrzymanym poprzez zmieszanie cieczy lub ze sk³adni-
kami eluentu (A, B, C, D), niekiedy wyposa¿one w system odgazowania helem
(nale¿y pamiêtaæ, aby nie dopuœciæ do rozwoju ¿ycia biologicznego w eluen-
cie !).
- filtr cieczy z porowatego spieku ze stali kwasoodpornej, polimeru albo cerami-
ki.
2, 2'
- pompa
3 (D)
- zawór dozuj¹cy albo automatyczny podajnik próbek,
Ko
- kolumna ochronna - zwana czêsto “prekolumn¹”,
(5) K
- w³aœciwa kolumna rozdzielaj¹ca,
4
- termostat kolumny i pêtli dozuj¹cej (korzystnie w zakresie od 4 do 140°C)
6
- detektor lub szeregowo, albo równolegle po³¹czone detektory,
7
- integrator lub komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych oraz
sterowania modu³ami aparatu,
8
- mieszalnik statyczny lub dynamiczny,
PK
- prekolumna - bywa stosowana w celu nasycenia eluentu faz¹ stacjonarn¹ (dla
zabezpieczenia w³aœciwej kolumny przed “zdzieraniem” fazy stacjonarnej
przez eluent i zwiêkszenia czasu ¿ycia kolumny).
136
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
F
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 137
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
9.1.
NAJWA¯NIEJSZE MODU£Y SK£ADOWE APARATU HPLC
1. Pompa
Rys. 9.4. Charakterystyki pomp stosowanych w chromatografii cieczowej.
Kolumna I: schematy budowy pomp;
A. - pompa membranowa,
B. - pompa t³okowa “nie odwracaj¹ca” odcinków przebiegu programu elucji,
C. - pompa t³okowa “odwracaj¹ca” odcinki przebiegu programu elucji,
D. - pompa zêbata, œrubowa, helikoidalna albo perystaltyczna
kolumna II: schematyczne wykresy stê¿enia na wylocie z odpowiedniej pompy liniowego programu
elucji wprowadzonego po stronie ss¹cej (w przypadku pompy typy C zaznaczono zjawisko
“odwracania” odcinków przebiegu linii prostej);
kolumna III: alternatywne sposoby wzajemnego usytuowania i wspó³pracy g³owic pompy:
a) pompa z jedn¹ g³owic¹ czynn¹;
b) pompa z jedn¹ g³owic¹ czynn¹ i jedn¹ g³owic¹ biern¹ (antypulsacyjn¹);
c) pompa z dwiema g³owicami czynnymi o przesuniêciu fazowym ruchu t³oków 180°;
d) pompa trójg³owicowa (120° przesuniêcie fazowe ruchu t³oków);
kolumna IV: wykresy zmian natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania (-) i po stronie t³oczenia (+)
pompy: - o sinusoidalnej( a', b', c', d'), prostok¹tnej (c”) i trapezowej (d”) charakterystyce po
stronie ssania i t³oczenia;
przebiegi wydajnoœci bez oporu przep³ywu (∆
P
= 0),
przebiegi wydajnoœci w warunkach podwy¿szonego ciœnienia pompowania (∆
P
> 0),
gdy na pocz¹tku cyklu ss¹cego ciecz nie wp³ywa do g³owicy pompy;
Oznaczenia:
t
- czas,
v
- objêtoœæ;
n
- prêdkoœæ obrotowa pompy;
w
- natê¿enie przep³ywu eluentu,
X
- stê¿enie sk³adnika B, C w eluencie na wylocie z pompy.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
137
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 138
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Najczêœciej jest to pompa t³okowa o posuwisto - zwrotnym ruchu t³oka i o niewielkiej
pojemnoœci skokowej. G³ownie, z jednym czynnym i z jednym biernym t³okiem. T³ok “czynny”
pompuje ciecz, pracuj¹c jako pompa ss¹co t³ocz¹ca. Ta czêœæ g³owicy posiada samoczynnie
dzia³aj¹ce zawory zwrotne, których elementy wykonano z syntetycznego szafiru, rubinu, albo z
ceramiki. Drugi t³ok jest t³okiem “biernym”. Wykonuje ruch posuwisto - zwrotny przesuniêty w
fazie o 180° i pracuje z wydajnoœci¹ ok. 50% wydajnoœci t³oczenia t³oka czynnego. Pe³ni on rolê
antypulsatora i ta czêœæ g³owicy nie ma zaworów zwrotnych. Wydajnoœæ pompy jest najczêœciej
regulowana automatycznie w zakresie 0,1 - 10 ml/min przy maksymalnym ciœnieniu do 43 / 45
MPa. Mo¿e byæ te¿ utrzymywane sta³e ciœnienie pracy pompy i wtedy mo¿e ona s³u¿yæ do
wype³niania kolumn HPLC.
Stosowane te¿ bywaj¹ pompy z dwiema lub trzema równoleg³ymi g³owicami czynnymi,
wyposa¿onymi w zawory ss¹co-t³ocz¹ce, zw³aszcza w aparatach do preparatywnych zastosowañ
HPLC (10 - 100 ml/min). Wtedy t³oki s¹ napêdzane w ten sposób, aby w maksymalnym stopniu
eliminowane by³y pulsacje ciœnienia (przesuniêcie fazowe odpowiednio o 180, albo 120 stopni
k¹towych). Tego typu pompy nie posiadaj¹ g³owic biernych, pe³ni¹cych rolê antypulsatora. Pul-
sacje s¹ eliminowane dziêki przesuniêciu fazowemu pracy t³oków. Na rys 9.4 przedstawiono
charakterystyki pracy pomp.
Elementy pomp, maj¹ce stycznoœæ z ciecz¹, wykonane s¹ z wysokiej jakoœci stali kwaso-
odpornej, teflonu, szk³a, wêgla szklistego, szafiru, rubinu i ceramiki. W tzw. zastosowaniach
“biokompatybilnych” zamiast stali kwasoodpornej stosuje siê tytan, albo tworzywo o nazwie
PEEK. W tym ostatnim przypadku pompy mog¹ najczêœciej pracowaæ tylko do ciœnienia 15 MPa.
Rys. 9.5. Schemat ideowy pompy ss¹co t³ocz¹cej do HPLC z jednym czynnym i jednym biernym t³o-
kiem oraz uproszczony przebieg natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania i t³oczenia (w rzeczy-
wistoœci przebiegi cykli t³oczenia nak³adaj¹ siê wzajemnie, a czas trwania ka¿dego cyklu ssania jest
skrócony, a amplituda zwiêkszona - patrz rys. 9.4)
Rys. 9.6. Schemat ideowy pompy dwug³owicowej do HPLC z dwoma czynnymi t³okami oraz uprosz-
czony przebieg natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania i t³oczenia (w rzeczywistoœci przebiegi
cykli t³oczenia nak³adaj¹ siê wzajemnie, a czas trwania ka¿dego cyklu ssania jest nieco skrócony, a
amplituda nieco zwiêkszona - patrz rys. 9.4).
138
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 139
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Innego typu pompy, albo tzw. bezpompowe urz¹dzenia transportuj¹ce eluent do i przez
kolumnê, takie, jak pompy membranowe, strzykawkowe, albo tzw. bezpompowe systemy zasila-
j¹ce, oparte o bezpoœrednie wykorzystanie sprê¿onego gazu obojêtnego, znajduj¹ obecnie mar-
ginalne zastosowanie. Pompy membranowe bywaj¹ stosowane do chromatografii cieczowej w
skali preparatywnej, a pompy strzykawkowe w chromatografach cieczowych z tzw. kolumnami
mikropakowanymi o œrednicy wewnêtrznej 0.5 do 1 mm. Urz¹dzenia bezpompowe zasilane
sprê¿onym He, Ar lub N
2
, maj¹ znaczenie historyczne i zastosowanie w ma³o kosztownych i
niezawodnych aparatach do zastosowañ dydaktycznych.
2. Zawór dozuj¹cy lub automatyczny podajnik próbek
Rys. 9.7. Uproszczony schemat dzia³ania zaworu dozuj¹cego z pêtl¹
po³¹czenie przewodów w czasie nape³niania pêtli dozuj¹cej (“load”)
po³¹czenie przewodów w czasie dozowania próbki do kolumny (“inject”)
Prawie zawsze jest stosowany zawór Rheodyne Rh 7125 lub inny zawór dozuj¹cy tego
producenta, charakteryzuj¹cego siê szczególnie wysok¹ jakoœci¹ wykonania.
Pojemnoœci pêtli:
20
µ
l
⎫
−
klasyczne
"
;
1
µ
l
−
kolumny
;
100
µ
l
⎫
skala
5
µ
l
1000
µ
l
semipreparatywna chromatografia lub oznaczanie sk³adników œladowych.
Mo¿na dozowaæ ca³¹ objêtoœæ pêtli. Wtedy w celu ca³kowitego wype³nienia pêtli i
otrzymywania powtarzalnych wyników trzeba wprowadziæ ponad 2.5 krotn¹ objêtoœæ pêtli dozu-
j¹cej do zaworu ustawionego w pozycji “load”. Mo¿na wprowadzaæ te¿ czêœæ objêtoœci pêtli
dozuj¹cej (poni¿ej 0.5 objêtoœci pêtli), oddzielaj¹c w strzykawce próbkê od ma³ych porcji eluen-
tu, pêcherzykami powietrza.
3. Kolumny HPLC
Kolumny s¹ zbudowane z wysokiej jakoœci stali kwasoodpornej, albo szk³a wêgla, polime-
ru PEEK oraz z teflonu. Wype³nienie: porowaty sorbent, albo faza stacjonarna o mo¿liwie
kulistych i jak naj-mniejszych ziarnach. Stosuje siê bardzo wiele rodzajów wype³nieñ kolumn
HPLC o zró¿nicowanych mechanizmach oddzia³ywañ sorpcyjnych. Z³o¿a wype³nieñ kolumn
HPLC otrzymuje siê najczêœciej “na mokro” pod wysokim ciœnieniem. Kolumny preparatywne
s¹ czêsto wyposa¿one, dodatkowo, w system zapewniaj¹cy osiow¹ kompresjê z³o¿a. Dla
zachowania dobrej rozdzielczoœci kolumny, szkodliwe mog¹ byæ szybkie zmiany ciœnienia elu-
entu, udary mechaniczne, a niekiedy tak¿e, dopuszczenie do wyschniêcia wype³nienia. W ostat-
nich latach trwa rozwój tzw. monolitycznych wype³nieñ kolumn, nie posiadaj¹cych wype³nienia
w postaci ziarnistej. Kolumny te cechuj¹ siê szczególnie korzystn¹, bardzo nisk¹ wartoœci¹ tzw.
“impedancji rozdzielania”.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
139
"
µ
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl hannaeva.xlx.pl
9. APARATURA, KOLUMNA, SPRAWNOή ROZDZIELANIA,
PRZEPUSZCZALNOή KOLUMNY
Marian Kamiñski
9.1.
APARATURA
Najwa¿niejsi producenci chromatografów cieczowych oferuj¹ obecnie aparaty HPLC
o budowie modu³owej i o bardzo zbli¿onych zasadach konstrukcji poszczególnych modu³ów.
Ró¿nice polegaj¹ na jakoœci materia³ów i czêœci elektronicznych, a tak¿e jakoœci wykonania i
trwa³oœci. Wiêksze ró¿nice maj¹ miejsce w zakresie funkcji oprogramowania i wygody
u¿ytkowania. Istotne ró¿nice bywaj¹ w zakresie wyposa¿enia aparatu w detektory ró¿nego typu
i ró¿ne czêsto s¹ parametry u¿ytkowe oferowanych detekto-rów. Warto zwróciæ uwagê czy pro-
ducent aparatury legitymuje siê certyfikatem systemu za-pewnienia jakoœci w/g normy ISO
9001.
Najwa¿niejsze schematy ideowe (uk³ady modu³ów i elementów) chromatografu cie-
czowego:
A) Aparat typu izokratycznego (sta³y sk³ad eluentu)
Rys. 9.1. Schemat ideowy wysokosprawnego chromatografu cieczowego HPLC do zastosowañ w
warunkach elucji izokratycznej; (znaczenie symboli opisano nieco dalej)
B) Aparat typu gradientowego (programowanie zmian sk³adu eluentu albo programowanie
sta³ego sk³adu eluentu kilkusk³adnikowego).
Ró¿nica dotyczy tylko modu³ów 1 i 2. na rys. 9.1., tzn. systemu zasilania kolumny elu-
entem. Systemy zasilania kolumny wystêpuj¹ w aparatach ró¿nego typu i ró¿nej ceny w dwóch
opcjach:
a) z zastosowaniem zaworów proporcjonuj¹cych ZA do ZD (rys. 9.2) - doprowadzanie na
przemian poszczególnych sk³adników eluentu do pompy i mieszalnika w czasie okresu
proporcjonowania T (2-4 zawory proporcjonuj¹ce) po stronie ss¹cej pompy (tzw. “gra-
dient niskociœnieniowy” - opcja tañsza, lecz ma wady)
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
135
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 136
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Rys 9.2. Schemat ideowy modu³u programowania sk³adu cieczy po stronie ss¹cej pompy w aparacie
chromatograficznym (programowanie sk³adu eluentu z³o¿onego z jednego do czterech sk³adników)
b) z zastosowaniem dwóch do czterech równolegle pracuj¹cych pomp o wzajemnie
zmienianej wydajnoœci (rys. 9.3).
Rys. 9.3. Schemat ideowy zespo³u zasilania kolumny HPLC eluentem o programowanym sk³adzie z
zastosowaniem kilku równolegle pracuj¹cych pomp i mikromieszalnika 8 (tzw. "gradient wysoko-
ciœnieniowy")
Znaczenie symboli na rys. 9.1- 9.3:
1, 1', 1”, 1”' - Pojemniki z eluentem otrzymanym poprzez zmieszanie cieczy lub ze sk³adni-
kami eluentu (A, B, C, D), niekiedy wyposa¿one w system odgazowania helem
(nale¿y pamiêtaæ, aby nie dopuœciæ do rozwoju ¿ycia biologicznego w eluen-
cie !).
- filtr cieczy z porowatego spieku ze stali kwasoodpornej, polimeru albo cerami-
ki.
2, 2'
- pompa
3 (D)
- zawór dozuj¹cy albo automatyczny podajnik próbek,
Ko
- kolumna ochronna - zwana czêsto “prekolumn¹”,
(5) K
- w³aœciwa kolumna rozdzielaj¹ca,
4
- termostat kolumny i pêtli dozuj¹cej (korzystnie w zakresie od 4 do 140°C)
6
- detektor lub szeregowo, albo równolegle po³¹czone detektory,
7
- integrator lub komputerowy system rejestracji i przetwarzania danych oraz
sterowania modu³ami aparatu,
8
- mieszalnik statyczny lub dynamiczny,
PK
- prekolumna - bywa stosowana w celu nasycenia eluentu faz¹ stacjonarn¹ (dla
zabezpieczenia w³aœciwej kolumny przed “zdzieraniem” fazy stacjonarnej
przez eluent i zwiêkszenia czasu ¿ycia kolumny).
136
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
F
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 137
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
9.1.
NAJWA¯NIEJSZE MODU£Y SK£ADOWE APARATU HPLC
1. Pompa
Rys. 9.4. Charakterystyki pomp stosowanych w chromatografii cieczowej.
Kolumna I: schematy budowy pomp;
A. - pompa membranowa,
B. - pompa t³okowa “nie odwracaj¹ca” odcinków przebiegu programu elucji,
C. - pompa t³okowa “odwracaj¹ca” odcinki przebiegu programu elucji,
D. - pompa zêbata, œrubowa, helikoidalna albo perystaltyczna
kolumna II: schematyczne wykresy stê¿enia na wylocie z odpowiedniej pompy liniowego programu
elucji wprowadzonego po stronie ss¹cej (w przypadku pompy typy C zaznaczono zjawisko
“odwracania” odcinków przebiegu linii prostej);
kolumna III: alternatywne sposoby wzajemnego usytuowania i wspó³pracy g³owic pompy:
a) pompa z jedn¹ g³owic¹ czynn¹;
b) pompa z jedn¹ g³owic¹ czynn¹ i jedn¹ g³owic¹ biern¹ (antypulsacyjn¹);
c) pompa z dwiema g³owicami czynnymi o przesuniêciu fazowym ruchu t³oków 180°;
d) pompa trójg³owicowa (120° przesuniêcie fazowe ruchu t³oków);
kolumna IV: wykresy zmian natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania (-) i po stronie t³oczenia (+)
pompy: - o sinusoidalnej( a', b', c', d'), prostok¹tnej (c”) i trapezowej (d”) charakterystyce po
stronie ssania i t³oczenia;
przebiegi wydajnoœci bez oporu przep³ywu (∆
P
= 0),
przebiegi wydajnoœci w warunkach podwy¿szonego ciœnienia pompowania (∆
P
> 0),
gdy na pocz¹tku cyklu ss¹cego ciecz nie wp³ywa do g³owicy pompy;
Oznaczenia:
t
- czas,
v
- objêtoœæ;
n
- prêdkoœæ obrotowa pompy;
w
- natê¿enie przep³ywu eluentu,
X
- stê¿enie sk³adnika B, C w eluencie na wylocie z pompy.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
137
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 138
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Najczêœciej jest to pompa t³okowa o posuwisto - zwrotnym ruchu t³oka i o niewielkiej
pojemnoœci skokowej. G³ownie, z jednym czynnym i z jednym biernym t³okiem. T³ok “czynny”
pompuje ciecz, pracuj¹c jako pompa ss¹co t³ocz¹ca. Ta czêœæ g³owicy posiada samoczynnie
dzia³aj¹ce zawory zwrotne, których elementy wykonano z syntetycznego szafiru, rubinu, albo z
ceramiki. Drugi t³ok jest t³okiem “biernym”. Wykonuje ruch posuwisto - zwrotny przesuniêty w
fazie o 180° i pracuje z wydajnoœci¹ ok. 50% wydajnoœci t³oczenia t³oka czynnego. Pe³ni on rolê
antypulsatora i ta czêœæ g³owicy nie ma zaworów zwrotnych. Wydajnoœæ pompy jest najczêœciej
regulowana automatycznie w zakresie 0,1 - 10 ml/min przy maksymalnym ciœnieniu do 43 / 45
MPa. Mo¿e byæ te¿ utrzymywane sta³e ciœnienie pracy pompy i wtedy mo¿e ona s³u¿yæ do
wype³niania kolumn HPLC.
Stosowane te¿ bywaj¹ pompy z dwiema lub trzema równoleg³ymi g³owicami czynnymi,
wyposa¿onymi w zawory ss¹co-t³ocz¹ce, zw³aszcza w aparatach do preparatywnych zastosowañ
HPLC (10 - 100 ml/min). Wtedy t³oki s¹ napêdzane w ten sposób, aby w maksymalnym stopniu
eliminowane by³y pulsacje ciœnienia (przesuniêcie fazowe odpowiednio o 180, albo 120 stopni
k¹towych). Tego typu pompy nie posiadaj¹ g³owic biernych, pe³ni¹cych rolê antypulsatora. Pul-
sacje s¹ eliminowane dziêki przesuniêciu fazowemu pracy t³oków. Na rys 9.4 przedstawiono
charakterystyki pracy pomp.
Elementy pomp, maj¹ce stycznoœæ z ciecz¹, wykonane s¹ z wysokiej jakoœci stali kwaso-
odpornej, teflonu, szk³a, wêgla szklistego, szafiru, rubinu i ceramiki. W tzw. zastosowaniach
“biokompatybilnych” zamiast stali kwasoodpornej stosuje siê tytan, albo tworzywo o nazwie
PEEK. W tym ostatnim przypadku pompy mog¹ najczêœciej pracowaæ tylko do ciœnienia 15 MPa.
Rys. 9.5. Schemat ideowy pompy ss¹co t³ocz¹cej do HPLC z jednym czynnym i jednym biernym t³o-
kiem oraz uproszczony przebieg natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania i t³oczenia (w rzeczy-
wistoœci przebiegi cykli t³oczenia nak³adaj¹ siê wzajemnie, a czas trwania ka¿dego cyklu ssania jest
skrócony, a amplituda zwiêkszona - patrz rys. 9.4)
Rys. 9.6. Schemat ideowy pompy dwug³owicowej do HPLC z dwoma czynnymi t³okami oraz uprosz-
czony przebieg natê¿enia przep³ywu cieczy po stronie ssania i t³oczenia (w rzeczywistoœci przebiegi
cykli t³oczenia nak³adaj¹ siê wzajemnie, a czas trwania ka¿dego cyklu ssania jest nieco skrócony, a
amplituda nieco zwiêkszona - patrz rys. 9.4).
138
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
aparatura, kolumna, sprawnosc.qxp 2004-06-15 23:21 Page 139
Aparatura, Kolumna, SprawnoϾ rozdzielania, PrzepuszczalnoϾ kolumny
Innego typu pompy, albo tzw. bezpompowe urz¹dzenia transportuj¹ce eluent do i przez
kolumnê, takie, jak pompy membranowe, strzykawkowe, albo tzw. bezpompowe systemy zasila-
j¹ce, oparte o bezpoœrednie wykorzystanie sprê¿onego gazu obojêtnego, znajduj¹ obecnie mar-
ginalne zastosowanie. Pompy membranowe bywaj¹ stosowane do chromatografii cieczowej w
skali preparatywnej, a pompy strzykawkowe w chromatografach cieczowych z tzw. kolumnami
mikropakowanymi o œrednicy wewnêtrznej 0.5 do 1 mm. Urz¹dzenia bezpompowe zasilane
sprê¿onym He, Ar lub N
2
, maj¹ znaczenie historyczne i zastosowanie w ma³o kosztownych i
niezawodnych aparatach do zastosowañ dydaktycznych.
2. Zawór dozuj¹cy lub automatyczny podajnik próbek
Rys. 9.7. Uproszczony schemat dzia³ania zaworu dozuj¹cego z pêtl¹
po³¹czenie przewodów w czasie nape³niania pêtli dozuj¹cej (“load”)
po³¹czenie przewodów w czasie dozowania próbki do kolumny (“inject”)
Prawie zawsze jest stosowany zawór Rheodyne Rh 7125 lub inny zawór dozuj¹cy tego
producenta, charakteryzuj¹cego siê szczególnie wysok¹ jakoœci¹ wykonania.
Pojemnoœci pêtli:
20
µ
l
⎫
−
klasyczne
"
;
1
µ
l
−
kolumny
;
100
µ
l
⎫
skala
5
µ
l
1000
µ
l
semipreparatywna chromatografia lub oznaczanie sk³adników œladowych.
Mo¿na dozowaæ ca³¹ objêtoœæ pêtli. Wtedy w celu ca³kowitego wype³nienia pêtli i
otrzymywania powtarzalnych wyników trzeba wprowadziæ ponad 2.5 krotn¹ objêtoœæ pêtli dozu-
j¹cej do zaworu ustawionego w pozycji “load”. Mo¿na wprowadzaæ te¿ czêœæ objêtoœci pêtli
dozuj¹cej (poni¿ej 0.5 objêtoœci pêtli), oddzielaj¹c w strzykawce próbkê od ma³ych porcji eluen-
tu, pêcherzykami powietrza.
3. Kolumny HPLC
Kolumny s¹ zbudowane z wysokiej jakoœci stali kwasoodpornej, albo szk³a wêgla, polime-
ru PEEK oraz z teflonu. Wype³nienie: porowaty sorbent, albo faza stacjonarna o mo¿liwie
kulistych i jak naj-mniejszych ziarnach. Stosuje siê bardzo wiele rodzajów wype³nieñ kolumn
HPLC o zró¿nicowanych mechanizmach oddzia³ywañ sorpcyjnych. Z³o¿a wype³nieñ kolumn
HPLC otrzymuje siê najczêœciej “na mokro” pod wysokim ciœnieniem. Kolumny preparatywne
s¹ czêsto wyposa¿one, dodatkowo, w system zapewniaj¹cy osiow¹ kompresjê z³o¿a. Dla
zachowania dobrej rozdzielczoœci kolumny, szkodliwe mog¹ byæ szybkie zmiany ciœnienia elu-
entu, udary mechaniczne, a niekiedy tak¿e, dopuszczenie do wyschniêcia wype³nienia. W ostat-
nich latach trwa rozwój tzw. monolitycznych wype³nieñ kolumn, nie posiadaj¹cych wype³nienia
w postaci ziarnistej. Kolumny te cechuj¹ siê szczególnie korzystn¹, bardzo nisk¹ wartoœci¹ tzw.
“impedancji rozdzielania”.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
139
"
µ