Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
Mogę Państwu obiecać, że jeśli ktoś dziś nie zrozumie biochemii żółtaczek, to już nigdy tego nie zrozumie, a będzie się to pojawiało przez resztę studiów na internie, chorobach zakaźnych itd.
Tu są takie dwa ważne białka, których zadaniem jest wiązanie tlenu:
Pierwsze to znana dobrze jeszcze ze szkoły podstawowej to hemoglobina, o budowie tetrameru z czterema ugrupowaniami hemowymi, a każdy atom żelaza zaznaczono tutaj jako żółta kulka. Hemoglobiną będziemy się zajmować w różnych odsłonach. Degradacja, diagnostyka laboratoryjna, mechanizm wiązania tlenu, zmiany konformacji atomu żelaza w momencie przyłączenia tlenu, konsekwencje utlenienia żelaza dla wiązania przez hemoglobinę no i inne z tym związane sprawy. W tym roku będę bardzo często pytał o transport gazów w osoczu. Sprawa biosyntezy będzie szczegółowo omawiana na ćwiczeniu laboratoryjnym poświęconym barwnikom żółciowym i porfirynom. Całą diagnostykę, degradacja pierścienia porfirynowego będzie dzisiaj omówiona natomiast pan adiunkt Wojakowski omówi porfirie, czyli zaburzenia genetycznie uwarunkowane lub nabyte w biosyntezie hemoglobiny, które mają istotne znaczenie praktyczne. Pod takim kątem należy się tego uczyć, nie wzorów poszczególnych uroporfiryn, koproporfiryn, tylko aspektu praktycznego.
SukcynyloCoA Glicyna
Syntaza ALA
Protoporfiryna III (IX) Synteza Synteza
Fe2+
Łań. a Łań. b
Ferrocholataza
Hem Łań. a Łań. b
Hemoglobina
Ostatnio Państwu pokazywałem taką reakcję anaplerotyczną, która swój rodowód bierze z cyklu Krebsa, mianowicie kondensacja sukcynyloCoA z glicyną, reakcja katalizowana przez syntazę kwasu d (- aminolewulinianowego (ALA), w konsekwencji licznych przemian dochodzi do powstania protoporfiryny IX, dalej następuje wbudowanie żelaza i powstaje hem. Niezależnie od siebie syntetyzowane są łańcuchy globiny, bo jest to tetramerzbudowany z dwóch łańcuchów alfa i dwóch beta, następuje zasocjowanie składnika niebiałkowego z składnikiem białkowym i powstaje hemoproteid jakim jest hemoglobina. Tlen w tym całym układzie oprócz syntezy hemoglobiny pełni kluczową rolę regulatorową w biosyntezie hemoglobiny, mianowicie hamuje syntazę kwasu g (- aminolewulinianowego (ALA). Istota porfirii polega na tym, że wskutek jakiegoś defektu enzymatycznego, po drodze, hem nie powstaje, w związku z czym następuje odhamowanie syntazy ALA i następuje produkcja pochodnych przed miejscem bloku, które z reguły są toksyczne, albo skóry, albo dla OUN. Również przypominam Państwu o konieczności przypomnienia sobie o roli erytropoetyny w produkcji hemoglobiny i generalnie w dojrzewaniu poszczególnych form erytroblastów. Główne miejsce wytwarzania erytropoetyny u człowieka to jest nerka. Są różne dysfunkcje nerek, choroby miąższu nerkowego, prowadzą one do zmniejszenia ilości erytropoetyny, a w konsekwencji zaburzają proces dojrzewania linii erytroblastycznej i prowadzą do niedokrwistości i obecnie uzyskana drogą inżynierii genetycznej erytropoetyna znalazła zastosowanie w leczeniu rozmaitych niedokrwistości. Ten układ zaznaczony na biało to jest hem. Kluczową rolę w hemie zajmuje żelazo na +2 stopniu utlenienia. Ten układ występuje nie tylko w hemoglobinie ale również w innych białkach.
Drugim bardzo istotnym białkiem jest mioglobina. Kilka słów potrzebnych na egzaminie o mioglobinie – siłą napędową przepływu tlenu w naszym organizmie jest różnica prężności tlenu w różnych przedziałach naszego organizmu, począwszy od płuc, a skończywszy na komórce, a ściślej mitochondrium. Jak łatwo zgadnąć w mitochondrium tlenu prawie nie ma ponieważ ulega czteroelektronowej redukcji i powstaje woda. Ciśnienie parcjalne tlenu zależy od ciśnienia atmosferycznego powietrza, a ponieważ stężenie tlenu wynosi około 20%, a ciśnienie oscyluje około 760 mmHg to można sobie wyobrazić, że ono wynosi tam około 120 mmHg. Te zmiany ciśnień parcjalnych i zmiany powinowactwa do tlenu poszczególnych barwników a w szczególności hemoglobiny i mioglobiny jest siłą napędową dla przepływu tlenu.
Teraz przeniesiemy się na chwilę w obręb komórki i to takiej komórki, która najbardziej na tlen czeka, mianowicie mięśni, które muszą pracować. W mięśniu znajduje się barwnik, który nazywa się mioglobina, zdarza się niestety czasami słyszeć, że to ma podobną budowę do hemoglobiny. Budowa mioglobiny absolutnie jest nie podobna do budowy hemoglobiny. Hemoglobina jest tetramerem, a mioglobina jest monomerem, jest białkiem niskocząsteczkowym o budowie globularnej, występują w nim liczne sekwencje helikalne i w przeciwieństwie do hemoglobiny ma tylko jedną resztę tlenu. resztę hemu.Z tym białkiem się Państwo spotkaliście przy omawianiu nieenzymatycznych markerów zawału mięśnia sercowego. Po uszkodzenia mięśnia mioglobina przenika do układu krążenia i tam jakąś metodą immunologiczną może być wykryta.
Druga cech, cecha,która wynika z budowy to jest całkowicie inna kinetyka aktywacji „tlenu”, mianowicie mioglobina ma taką krzywą aktywacji, jaka jest typowa przy enzymach monomerycznych, czyli krzywa hiperboliczna. Tak należy interpretować, że przy bardzo niskim ciśnieniu parcjalnym tlenu ulega bardzo szybko wysycaniu, czyt. również oddaniu tlenu i oksyhemoglobina przekazuje tlen hemoglobiniemiogloginie.. Jeśli ciśnienie parcjalne tlenu zaczyna gwałtownie spadać, tak jak jest w warunkach wysiłku tlenowego, długu tlenowego i w mitochondriach i w cytozolu ciśnienie parcjalne tlenu jest bardzo niskie wtedy następuje oddawanie tlenu mioglobinie i przekazywanie jej do mitochondrium po to aby mogły w ogóle zachodzić przemiany tlenowe w mitochondriach w warunkach wysiłku fizycznego, czyli jest to depot tlenu w mięśniu, natomiast krzywa dysocjacji w hemoglobinie przypomina kinetykę enzymu o budowie podjednostkowej, enzymu allosterycznego.
Wysycenie
białka tlenem
Prężność O2
Hemoglobina jest faktycznie białkiem allosterycznym, nie enzymem, o budowie tetrameru. Powstaje pytanie: czemu mioglobina nie mogła by zastąpić hemoglobiny? Bo w tych warunkach ciśnień parcjalnych tlenu, które występują w warunkach kapilar, czyli tam gdzie hemoglobina musi się szybko pozbywać tlenu i oddawać tkankom jest w całości nasycona tlenem, ona nie ma chęci w ciśnieniach parcjalnych tlenu w tkankach oddawać tlenu dla struktur komórkowych, które zajmują się metabolizmem tlenowym. Czyli porównując hemoglobinę z mioglobiną – to hemoglobina jest taką mioglobiną, której krzywa dysocjacji przesunęła się w prawo. Tu mamy krzywą hiperboliczną, a tu sigmoidalną, czyli spełniającą równanie Hill’a.
Zatrucie tlenkiem węgla
Kolejna sprawa to zatrucie tlenkiem węgla. Powstaje coś co nazywamy karboksyhemoglobiną, proszę tego nie mylić z karbamylohemoglobiną, która jest formą transportu CO2 w połączeniu z resztami aminowymi hemoglobiny, to nie jest łączenie z centrum hemu, czyli tam gdzie znajduje się żelazo, ale jest to powiązanie z resztami aminowymi hemoglobiny. Natomiast w wyniku asocjacji CO z atomem żelaza i utworzenia wiązania w tym miejscu następuje gwałtowne zmniejszenie powinowactwa do tlenu. Powinowactwo tlenku węgla jest wielokrotnie większe różne in vivo, in vitro a jest to spowodowane konformacją nie tylko tlenu, hemu,ale samego białka jakim jest hemoglobina. W warunkach in vitro gdyby wyzwolić cały układ hemu z połączenia z globiną, jest mniej więcej 100 razy większe powinowactwo do tlenku węgla niż w warunkach in vivo, gdzie jest ponad 200 razy większe niż powinowactwo do tlenu. Czyli łatwo zgadnąć, że w warunkach in vitro hemoglobina ma około 20000 razy większe powinowactwo do CO niż do tlenu.
Druga pochodna, która powstaje w reakcji z jonem cyjankowym, to jest cyjanohemoglobina, gdy się utleni powstaje cyjanomethemoglobina - podstawa teoretyczną podstawowej reakcji w oznaczaniu stężenia hemoglobiny, a mianowicie reakcji Drabkina, która jest powszechnie stosowana do oznaczeń stężenia hemoglobiny.
Zaburzenia w biosyntezie hemoglobiny
Mamy tu dwie grupy zaburzeń:
· hemoglobinopatie
· talasemie.
Hemoglobinopatia – to synteza prawidłowych łańcuchów, czyli łańcucha alfa i beta, ale w którymś z tych łańcuchów, w jednym albo w dwóch, albo w jednym w kilku miejscach w wyniku mutacji punktowej genu kodującego ten łańcuch powstaje łańcuch o nieprawidłowej sekwencji aminokwasowej. Takich wariantów jest opisanych w tej chwili ponad 700, a 100 występuje dość często i ma dość istotne znaczenie praktyczne. Jakie są konsekwencje takiej mutacji?
· Pierwsza to jest powstanie tzw. hemoglobiny niestabilnej, hemoglobina niestabilna może ulegać krystalizacji i w konsekwencji krwinka zmienia swój kształt, a przez to zmieniają się właściwości reologiczne krwi i druga konsekwencja – powstają tzw. hemoglobiny niestabilne, które prowadzą do hemolizy krwinki, czyli krwinka się rozpada. To jest jedna grupa konsekwencji.
· Druga grupa konsekwencji wiąże się z tym, że paradoksalnie taka zmieniona hemoglobina ma większe powinowactwo do tlenu. Krzywa dysocjacji przesuwa się w stronę lewą, w efekcie nie ma wcale ochoty w tkankach obwodowych oddawać tlenu. W efekcie rozwija się hipoksja, czyli niedotlenienie tkanek. Jeśli rzecz dotknie nerki to w konsekwencji jest większa synteza erytropoetyny i zamiast spodziewanej niedokrwistości występuje nadkrwistość, czyli erytrocytoza – pobudzenie szpiku kostnego do syntezy erytrocytów, w których hemoglobina ma większe powinowactwo do tlenu, a przez to gorzej oddaje tlen tkankom.
Najczęstszą taką hemoglobinopatią jest hemoglobinopatia S – to jest mutacja punktowa polegająca na substytucji jednej zasady w genie kodującym łańcuch beta i w konsekwencji tego zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 6 łańcucha beta powstaje walina. Jeśli ciśnienie parcjalne tlenu jest duże wtedy nie dzieje się nic, natomiast w warunkach hipoksji, taka hipoksja względna występuje w każdym miejscu gdzie następuje zwolnienie przepływu krwi, następuje pobór tlenu przez tkankę, następuje krystalizacja hemoglobiny i w konsekwencji krwinka czerwona przybiera kształt sierpowaty, ta hemoglobinopatia S znana jest jako anemia sierpowata. Szczególnie często występuje u rasy czarnej, szczególnie w strefie równikowej. W erytrocytach ludzi z hemoglobinopatią S nie rozwijają się jednak formy zarodźca malarii.
Talasemie - druga grupa zaburzeń, które trzeba od hemoglobinopatii odróżniać. Jest to defekt polegający na niezdolności do syntezy któregoś z łańcuchów hemoglobiny. Na to miejsce jest syntetyzowany inny łańcuch, bo hemoglobina jest tetramerem i w takiej formie przenosi tlen, szczególnie często talasemie występują w basenie Morza Śródziemnego.
Dobrnęliśmy wreszcie do momentu kiedy erytrocyt kończy swój żywot, ten żywot trwa około 100 do 120 dni z tego wynika, że 1% dziennie przechodzi na emeryturę. Przejście na emeryturę może odbywać się w tzw. dwóch odsłonach, albo w procesie hemolizy zewnątrznaczyniowej, tak kończy żywot w warunkach prawidłowych mniej więcej 90% erytrocytów.
Natomiast 10% erytrocytów kończy żywot w obrębie naczynia, jest to tzw. hemoliza wewnątrznaczyniowa. Mechanizm jednej i drugiej jest absolutnie odmienny, nie mniej w pewnym momencie te mechanizmy się ze sobą spotykają. Proporcje zmieniają się w chorobach hemolitycznych, niedokrwistościach hemolitycznych, gdzie następuje niszczenie krwinek czerwonych i wówczas hemoliza wewnątrznaczyniowa może osiągnąć 100%, ponieważ żadna krwinka nie dojeżdża do miejsc, gdzie podlega hemolizie zewnątrznaczyniowej.
Zacznijmy od hemolizy zewnątrznaczyniowej – odbywa się w układzie siateczkowo – śródbłonkowym, proszę nie mówić, że w wątrobie, bo to tak jak by powiedzieć, że lipaza lipoproteinowa działa w tkance tłuszczowej, a w rzeczywistości działa w naczyniu. W komórkach Browicza – Kupffera, albo w układzie siateczkowo – śródbłonkowym śledziony następuje wyłapywanie i niszczenie erytrocytów, następnie uwolnienie hemu polegające na tym, że następuje otwarcie mostka retinowego, metinowego,jego utlenienie. To jest wciąż jeszcze hemoglobina, atak następuje na hem. Formą z otwartym tutaj mostkiem jest forma, która nosi nazwę choleglobina. Dalszy etap degradacji to jest uwolnienie tlenku węgla. Powstaje forma, która nazywa się werdoglobina, to jest ostatnią pochodna hemoglobiny w układzie siateczkowo – śródbłonkowym, która wciąż zawiera białko i żelazo, jest to zielony barwnik stąd jego nazwa werdoglobina.
Na tym etapie następuje rozpad trzech części :
· odłącza się część białkowa, która podlega degradacji proteolitycznej z wyzwoleniem wolnych aminokwasów,
· uwalnia się żelazo, które wcześniej się utleniło do pozycji +3 i w połączeniu z transferyną wędruje do miejsc w których żelazo jest deponowane i do miejsc syntezy hemoglobiny,
· hem, czyli ta część niebiałkowa pozbawiona żelaza podlega przemianie w biliwerdynę.
Choleglobina
O2
d a
CO
Fe2+
g b Werdoglobina
Fe3+ Globina
Hemoglobina
Biliwerdyna (zielona)
Bilirubina (żółta)
Następny etap również zachodzi w układzie siateczkowo – śródbłonkowym, polega na przekształceniu bilirubiny w biliwerdynę przy udziale reduktazy bilirubinowej. Biliwerdyna ma jeszcze barwę zieloną, bilirubina ma barwę żółtą. Jakie są źródła bilirubiny w naszym organizmie? Bilirubina powstaje z hemu, czyli źródłem są wszystkie białka zawierające hem, drugim źródłem jest hem pochodzący ze źródeł pozabiałkowych, np. w wyniku nieskutecznej erytropoezy. 85% to jest hem pochodzący z hemoglobiny, pozostałe mają znaczenie poboczne.
Struktura bilirubiny została opisana w roku 1942 i ona wygląda tak jak tu pokazano, nie mniej po opisaniu tej budowy okazało się, że nijak ta budowa nie przystaje do właściwości bilirubiny. Mianowicie przy pierścieniu B i C mamy resztę kwasu propionowego – to powinno stanowić o dobrej rozpuszczalności w wodzie bilirubiny. Tymczasem ta bilirubina, która powstała nam w układzie siateczkowo – śródbłonkowym jest bilirubiną nierozpuszczalną w wodzie, a rozpuszczalną w tłuszczach. W latach 60-tych w wyniku analizy krystalograficznej cząsteczki bilirubiny okazało się, że w rzeczywistości przyjmuje ona taką postać. Mianowicie powstają wiązania wodorowe między grupą karboksylową tego kwasu propionowego w pozycji B i C z azotem pierścienia pirolowego w odpowiednich pierścieniach. To wszystko sprawia, że w rzeczywistości reszty kwasu propionowego nie są dostępne dla środowiska wodnego i wszystko się zgadza. To co Państwo tutaj widzą jest to izomer Z – Z bilirubiny. Dużo bilirubiny powstaje w układzie siateczkowo – śródbłonkowym, a kiedy się tak dzieje to do tego dojdziemy.
Taka bilirubina nierozpuszczalna w wodzie po przedostaniu się do krążenia szuka sobie miejsc w których może się rozpuścić. Jeśli ktoś ma dużo tkanki tłuszczowej to rozpuszcza się w tkance tłuszczowej, zarówno wewnątrzbrzusznej jak i obwodowej. Jak ktoś nie ma dużo tkanki tłuszczowej to szuka sobie innego miejsca, czyli każdy ma takie miejsce w którym ma dużo tłuszczowców – OUN. W rezultacie uszkadza OUN i od dawna trwały badania, żeby coś zrobić z tą bilirubiną, oprócz sposobów czysto fizjologicznych można sprawić żeby te wiązania popękały. Można tego dokonać przy pomocy promieniowania UV, jeśli poświecić na osobę promieniami UV, wówczas te wiązania wodorowe pękają, bilirubina zmienia swoją postać z izomeru Z – Z, w tak zwany izomer E – E. Tak zmieniona bilirubina staje się rozpuszczalna w wodzie i tym samym może być wydalona z moczem. To zastosowano w leczeniu żółtaczki noworodków, które poddawano tzw. fototerapii. Jak noworodek jest z żółtaczką to stawia się nad nim lampę UV (osłaniając oczy) i w trakcie terapii noworodek się odżółca, ponieważ bilirubina zgromadzona w skórze zostaje wydalona z moczem, a miejsca chwytne na białka transportowe, konkretnie na albuminę mogą być tym samysamym wykorzystane przez tę bilirubinę, która mogła by się zlokalizować w OUN. W przypadku takiej terapii może u noworodka wystąpić niedobór witaminy B2. Powstała nam bilirubina w układzie siateczkowo – śródbłonkowym – tą bilirubinę nazywamy bilirubiną wolną. Ta bilirubina musi opuścić komórkę układu siateczkowo – śródbłonkowego, jest nierozpuszczalna w wodzie.
Dalszy jej metabolizm zachodzi w wodzie i w hepatocycie. Czyli musi na tę przejażdżkę wybrać wehikułem o nazwie albumina. Jeśli albuminy jest za mało albo bilirubiny wolnej jest za dużo, wówczas bilirubina nie jest związana z albuminą, szuka sobie miejsca, gdzie może się rozpuścić, przypominam jest to ...