Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
//-->.pos {position:absolute; z-index: 0; left: 0px; top: 0px;}terminacja translacji u Prokaryota i Eukaryotajan KutnerSTRESZCZENIEerminacja translacji różni się pod wieloma względami u organizmów prokariotycznychi eukariotycznych. W początkowej fazie terminacji biorą udział czynniki rozpoznającekodon stop w miejscu A rybosomu, zwane czynnikami terminacyjnymi. Czynniki te są od-powiedzialne za hydrolizę wiązania peptyd — tRNA i uwolnienie nowo syntetyzowanegobiałka. u Eukaryota występuje tylko jeden taki czynnik — eRF1, podczas gdy u Prokaryotaza proces ten odpowiedzialne są dwa czynniki — RF1 i RF2. W terminacji translacji mito-chondrialnej, procesowi zbliżonemu do terminacji translacji u Prokaryota, za rozpoznawaniekodonu stop odpowiedzialny jest jeden czynnik, zwany mRF1. Badania we wszystkich tychukładach ujawniły występowanie w czynnikach terminacyjnych ważnych domen biorącychudział w skomplikowanym etapie terminacji translacji. Praca ta ma na celu przybliżenie no-wych aspektów, dotyczących mechanizmu terminacji translacji, jak i prób wizualizowaniasamego procesu licznymi badaniami strukturalnymi.TZakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofi-zyki PAN, WarszawaZakład Genetyki, Instytut Biochemii iBiofizyki PAN, ul. Pawińskiego 5A, 02-106Warszawa; tel.: (022) 5921311, faks (022) 65846 36, e-mail: janek@ibb.waw.plArtykuł otrzymano 17 kwietnia 2007 r.Artykuł zaakceptowano 19 czerwca 2007 r.Słowa kluczowe:eRF1, hipoteza mimikrytRNA, kodon stop, mRF1, RF1, RF2, termi-nacja translacjiStosowane skróty:RFs — czynniki termi-nacyjne; PTC — centrum peptydylotrans-ferazy; mRF1 — mitochondrialny czynnikterminacji translacji; DC — centrum deko-dowaniaPodziękowanie:Chciałbym serdecznie po-dziękować prof. Magdalenie Bogucie orazdr Joannie Towpik za krytyczne uwagi i su-gestie w trakcie pisania tej pracy.WPROWADZENIEW procesie biosyntezy białka biorą udział mRNA, tRNA, czynniki transla-cyjne i rybosomy. Wszystkie te makromolekuły ściśle ze sobą współdziałają. Wprocesie translacji wyróżnia się cztery główne etapy: inicjację, elongację, termi-nację oraz odnawianie (ang.recycling).Sygnałem dla terminacji translacji jest pojawienie się w mRNA kodonu stop wmiejscu A rybosomu. Terminacja jest przeprowadzana przez specyficzne czyn-niki terminacyjne, opisywane symbolem RFs (ang.Release Factors).Najlepiej poznano proces terminacji translacji u bakterii. Pierwsza grupaczynników terminacyjnych odpowiada za rozpoznanie kodonu stop w mRNA.Czynniki te wiążą się do miejsca A w rybosomie oraz hydrolizują wiązanie estro-we peptyd-tRNA w miejscu P rybosomu, pozostawiając nienaładowany tRNAoraz wolny peptyd. Po odcięciu peptydu, czynnik terminacyjny pierwszej gru-py jest odłączany od rybosomu pod wpływem czynnika terminacyjnego drugiejgrupy, zależnego od GTP. Następnie, pod wpływem czynnika z trzeciej grupy,rybosom dysocjuje na składowe podjednostki, które są w stanie wziąć udział wnowej rundzie inicjacji translacji [1].BAKTERYJNE CZYNNIKI TERMINACJI TRANSLACJIProces terminacji translacji został najlepiej poznany u bakteriiEscherichia coli.Uczestniczą w nim dwa czynniki pierwszej grupy – RF1 i RF2, rozpoznające ko-dony stop, odpowiednio: UAA i UAG oraz UAA i UGA. Czynniki te oddziałująbezpośrednio z mRNA, hydrolizują wiązanie peptyd-tRNA, uwalniając białka zmiejsca P w rybosomie. Hydroliza wiązania peptyd–tRNA przeprowadzana jestprzy udziale sekwencji GGQ, zachowanej ewolucyjnie zarówno w prokariotycz-nych, jak i eukariotycznych czynnikach terminacji translacji pierwszej grupy.Rejon ten, poprzez wiązanie cząsteczki wody, „naśladuje” aminoacylo-tRNA iw ten sposób przyczynia się do hydrolizy wiązania estrowego [2].Poziom czynników terminacyjnych w komórceE. coliwynosi dla RF1 - 500, adla RF2 - 700 cząsteczek [3]. Nadekspresja czynników terminacyjnych jest letalna[4], a mutacje w genach kodujących RF1 (prfA) i RF2 (prfB) powodują niewłaści-we odczytanie kodonów stop, błędy w syntetyzowanym białku i temperaturow-rażliwy (ts) wzrost komórek [5] (Ryc. 1).Po rozpoznaniu kodonu stop (Ryc. 1, etap I) i uwolnieniu peptydu przez RF1lub RF2 (Ryc. 1, etap III), czynnik RF3 powoduje dysocjację RF1 lub RF2 z miej-sca A rybosomu przy udziale GTP. RF3 jest czynnikiem terminacyjnym drugiejgrupy, zależnym od GTP. Czynnik ten występuje w kompleksie z GDP poza420www.postepybiochemii.plRycina 1.Mechanizm terminacji translacji u bakterii (na podstawie [6]).rybosomem, zaś w kompleksie z GTP wtedy, gdy jest zwią-zany z rybosomem (Ryc. 1, etap V). Po związaniu się RF3następuje dysocjacja GDP, która stabilizuje wiązania. Stabi-lizacja ta trwa, aż do pojawienia się kolejnej cząsteczki GDP(Ryc. 1, etap II). RF3 w kompleksie z GDP może wiązać siędo rybosomu słabymi wiązaniami, które łatwo ulegają dy-socjacji (Ryc. 1, etap II). Takie niestabilne wiązanie, połączo-ne z szybką dysocjacją, powtarza się do czasu, gdy nastąpihydroliza wiązania peptyd–tRNA (Ryc. 1, etap III). Czynni-ki terminacyjne pierwszej grupy powodują wymianę GDP,związanego z RF3, na GTP (Ryc. 1, etap IV). Umożliwiają wten sposób jego trwałe związanie do rybosomu, które pro-wadzi do dysocjacji RF1/2 (Ryc. 1, etap V). Następnie, GTPw RF3 jest hydrolizowane i dysocjuje w formie GDP (Ryc.1, etap VI). Forma ta posiada niskie powinowactwo do ry-bosomu [6].W dalszej części procesu podjednostka rybosomalna 50Sdysocjuje od kompleksu mRNA●podjednostka 30S●tRNApod wpływem, zależnego od GTP, czynnika elongacyjnegoEF2 oraz czynnika terminacyjnego RRF, niezależnego odGTP, i bierze udział w kolejnej rundzie translacji. W końco-wym etapie deacetylowane tRNA jest usuwane z miejsca Ppodjednostki 30S rybosomu przez czynnik inicjacyjny IF3.Brak genu kodującego RRF jest letalny dla komórki bak-teryjnej, a sam proces rozpadu rybosomu na podjednostki30S i 50S jest niezbędny do ponownego użycia rybosomu,czynników terminacyjnych oraz tRNA w kolejnym etapiebiosyntezy peptydu [7].Terminacja translacji u bakterii była badana nie tylko wukładachin vivo,ale również w układachin vitro.Badania wukładziein vitrowykazały, że przy braku białek RF3 i RRFPostępy Biochemii 53 (4) 2007pełny cykl translacji trwa ok. 40 sekund. Okres ten zmniej-sza się do 30 sekund po dodaniu jedynie RF3 i do 15 sekundpo dodaniu samego RRF. W obecności obu tych czynnikówokres odnowy rybosomu wynosi 6 sekund. Stwierdzonorównież, że aktywność katalityczna RRF zależy od czynnikaelongacyjnego EF-G [8].EUKARIOTYCZNE CZYNNIKITERMINACJI TRANSLACJIU Eukaryota terminacja translacji cytoplazmatycznej za-chodzi z udziałem współdziałających ze sobą czynnikówterminacyjnych eRF1 i eRF3 (ang.eukaryotic Release Factor).UdrożdżyS. cerevisiaeproces ten zachodzi z udziałem białekSup35 (eRF3) i Sup45 (eRF1) [9]. Czynniki te tworzą kom-pleks zdolny do hydrolizy wiązania peptyd-tRNA. eRF1 jestczynnikiem pierwszej grupy, niezbędnym do życia komór-ki, rozpoznającym wszystkie trzy kodony stop i bezpośred-nio z nimi oddziałującym [10]. eRF3 jest czynnikiem drugiejgrupy, zależnym od GTP, i stymuluje aktywność eRF1 [9].eRF3 wiąże GTP tylko w kompleksie eRF1●eRF3 [11]. Po-wstały kompleks eRF1●eRF3●GTP●Mg2+powoduje akty-wację centrum GTPazy, wiąże się do rybosomu i następniepowoduje hydrolizę wiązania peptyd-tRNA (Ryc. 2).Zaproponowano model terminacji translacji u Eukary-ota [12]. W pierwszym etapie eRF1, eRF3 i GTP wiążą siędo kompleksu preterminacyjnego, składającego się z ry-bosomu związanego z kodonem stop w mRNA w miejscuA i peptydylo-tRNA w miejscu P (Ryc. 2, etap II). Utwo-rzenie na rybosomie kompleksu eRF1●eRF3●GTP powo-duje rearanżację kompleksu preterminacyjnego — tzn.translokację rybosomu na mRNA i związane z tym prze-421Rycina 2.Model terminacji translacji u Eukaryota (na podstawie [12]).mieszczenie kodonu stop do miejsca P, zaś peptydylo-tRNA do miejsca E (Ryc. 2, etap II). Zmiany strukturalnepolegają na częściowej lub całkowitej translokacji kodo-nu w mRNA wobec ramienia antykodonu w peptydylo-tRNA. Odpowiednie ułożenie motywu GGQ w eRF1, wmiejscu peptydylotransferazy (PTC) przegrupowującegosię kompleksu, wymaga hydrolizy GTP poprzez eRF3(Ryc. 2, etap III). eRF1 stymuluje GTPazową aktywnośćeRF3 [11]. Hydroliza wiązania eRF3●GTP może skutko-wać uwolnieniem eRF3●GDP z rybosomu lub modyfika-cją ich oddziaływania z eRF1 (Ryc. 2, etap III). Pozwala toz kolei na poprawne dopasowanie motywu GGQ do PTC.W etapie IV (Ryc. 2) odpowiednio ułożony eRF1 powo-duje hydrolizę peptydylo-tRNA. Kolejny etap może pole-gać na dysocjacji eRF1 wraz z eRF3 lub samego eRF1, jeślieRF3●GDP został uwolniony natychmiast po hydrolizieGTP.eRF3 posiada inne funkcje niż prokariotyczny RF3 [13].Podczas gdy RF3 stymuluje uwalnianie czynników RF1/2z rybosomu, eRF3, tworząc kompleks z eRF1, wpływa naszybką i wydajną hydrolizę wiązania peptyd–tRNA. UProkaryota hydroliza wiązania peptyd–tRNA poprzedzazmianę GTP, związanego z RF3, na GDP, podczas gdy uEukaryota hydroliza GTP i uwolnienie eRF3●GDP jestkonieczne do hydrolizy wiązania peptyd–tRNA. Powo-dem, dla którego eRF3 ma tak rozwiniętą funkcję, możebyć występowanie u Eukaryota tylko jednego czynnikarozpoznającego wszystkie kodony stop eRF1 – obniżenieselektywności w rozpoznawaniu kodonów stop oraz brakw układzie eukariotycznym prokariotycznego odpowied-nika RRF [12].U Eukaryota mRNA przedstawiono jako model „za-mkniętej pętli”, co sugerowałoby brak uwalniania podjed-nostki 40S w procesie terminacji [14]. Zamiast tego podjed-nostka 40S mogłaby kursować w poprzek lub na ogoniepoli(A) z powrotem do 5’-końca mRNA poprzez czynnikitranslacyjne połączone z 5’ i 3’-końcem. W tym modelu pro-ponowana jest raczej reinicjacja niż (lub dodatkowo) inicja-cja. Zostało to poparte odkryciem oddziaływania pomiędzyeRF3 i PABP (ang.Poly(A)-Binding Protein),wzmacniającymwiązanie aparatu terminacyjnego z 3’ końcem mRNA [1].Wykazano, że kompleks tworzony przez dwa czynniki,eRF1 i eRF3, znacznie wzmacnia powinowactwo eRF3 doGTP. Sam eRF3 w komórce eukariotycznej, poza komplek-sem, ma wyższe powinowactwo do GDP, podczas gdy wkompleksie z eRF1 ma wyższe powinowactwo do GTP. Wanalogiczny sposób EF-Tu tworzy kompleks z aminoacylo-wanym tRNA i GTP. Wskazuje to, iż kompleks eRF3●eRF1powoduje wzrost powinowactwa eRF3 do GTP, a równo-cześnie kompleks eRF3●GTP powoduje wzrost powino-wactwa eRF3 do eRF1. Sugeruje to, że eRF3 pod wpływemGTP zmienia swoją konformację tak, aby dopasować się dokompleksu z eRF1 i tworzy kompleks eRF3●GTP●eRF1.Natomiast białko PABP tworzy kompleks eRF3●GDP, aobecność GTP nie sprzyja jego tworzeniu. Dodanie PABPdo mieszaniny eRF1 i eRF3 obniża powinowactwo eRF3 doGTP [14,15].U ssaków występują dwa geny kodujące dwie różne for-my białka eRF3: eRF3a (GSPT1) i eRF3b (GSPT2). Wykazują87% podobieństwa sekwencji aminokwasowej, a najwięk-sza różnica występuje w N-końcowej domenie ich cząstecz-www.postepybiochemii.pl422ki. Również poziom ich ekspresji jest odmienny dla różnychtkanek. Oba wiążą się do eRF1 i powodują jego uwalnianieinvivo.Wykazano, że wyciszenie genu kodującego eRF3a po-woduje obniżenie przeczytywania (ang.readtrough)kodonunonsens w reporterowym mRNA, tzn. obniżenie wiernościtranslacji. Wyciszenie genu kodującego eRF3b nie powodujeżadnych znaczących efektów. Ponadto, nadekspresja genukodującego eRF3b niweluje efekt przeczytywania i spadkupoziomu komórkowego eRF1, powodowany wyciszeniemgenu kodującego eRF3a. Wskazuje to, że eRF3a jest głów-nym czynnikiem biorącym udział w terminacji translacji wkomórkach ssaków [16].RóŻNICE W tERmINACjI tRANSlACjI: uKłADPROKARIOTYCZNY I EUKARIOTYCZNYże terminacja translacji w organellach jest bardzo podob-na do translacji bakteryjnej. Mitochondria posiadają swójautonomiczny genom – mitochondrialne DNA (mtDNA) imaszynerię niezbędną do jego ekspresji. Drożdżowy mtD-NA koduje osiem białek, z których siedem wchodzi w składaparatu oddechowego, a jedno białko jest składnikiem małejpodjednostki mitochondrialnego rybosomu.Wszystkie ramki odczytu, kodujące osiem białek mi-tochondrialnych u drożdży, rozpoczynają się od kodonuAUG. Jednakże budowa mitochondrialnego mRNA jestbardziej złożona niż u Prokaryota i nie posiada charaktery-stycznej sekwencji „Shine-Dalgarno”. mRNA posiada 5’ nie-kodującą sekwencję (5’UTR), której długość waha się od 300do 950 par zasad przed właściwym kodonem start. Wydajesię, że kodon ten nie jest jedynym sygnałem startu transla-cji. Podobną strukturę wykazuje mRNA w chloroplastach.Struktura ta nie występuje w mitochondrialnym mRNAu ssaków. Translacja mitochondrialna dostarcza jedyniekilka białek kodowanych przez mtDNA. Pozostałe białkaniezbędne do funkcjonowania tych organelli kodowane sąjądrowo, syntetyzowane w cytoplazmie i importowane domitochondriów. Złożenie kompleksu oddechowego wyma-ga skoordynowanej ekspresji genów mitochondrialnych ijądrowych. Większość składników układu mitochondrial-nego kodowanych jądrowo jest funkcjonalna jedynie w mi-tochondriach. Wykazano istnienie enzymów związanychz biosyntezą i aminoacylacją tRNA, które są wspólne dlaukładu jądrowo-cytoplazmatycznego [24].W odróżnieniu od translacji w układzie bakteryjnym, winicjacji translacji mitochondrialnej biorą udział kodowaneprzez jądrowy genom aktywatory białkowe. Każdy mito-chondrialny mRNA ma inny zestaw białek znajdujących sięw wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Białka te wiążą siędo jego 5’-końca mRNA i kierują translację do błony mito-chondrialnej. Kolejne etapy translacji przebiegają podobniejak u Prokaryota.Terminacja translacji przeprowadzana jest przez jedynypoznany do tej pory czynnik terminacji translacji mitochon-drialnej – mRF1 (ang.mitochondrial Release Factor),kodowa-ny przez genMRF1.mRF1 jest homologiem bakteryjnychczynników RF1 i RF2. Rozpoznaje tylko dwa kodony stop:UAA i UAG, ponieważ UGA w układzie mitochondrialnymkoduje tryptofan [24]. mRF1 jest prawdopodobnie jedynymi wystarczającym czynnikiem rozpoznającym kodon stop wmitochondrialnym mRNA. Zaobserwowano lekko toksycz-ny efekt nadekspresjiMRF1u drożdżyS. cerevisiae[25]. Byćmoże u drożdży występuje czynnik terminacji translacji,będący analogiem RF3, jednak jak dotąd nie został zidenty-fikowany. Mitochondrialną rolę prokariotycznego czynnikaRRF odgrywa drożdżowy homolog Fil1, nazywany inaczejRrf1. Białko to jest związane z regulacją cyklu glioksalowe-go [26]. Delecja genuFIL1powoduje powstanie defektu od-dechowego i niestabilność mtDNA.Badania translacji mitochondrialnej drożdżyS. cerevi-siaemogą być prowadzone w układziein vivo.Translacjamitochondrialna nie jest potrzebna dla ich żywotności wobecności fermentowalnych cukrów. Pozwala to na izola-cję oraz analizę mitochondrialnych i jądrowych mutantów,Różnice w translacji w układzie prokariotycznym i euka-riotycznym wynikają już z samej budowy składników bio-rących w niej udział. Eukariotyczne rybosomy składają sięz dwóch podjednostek 60S i 40S, podczas gdy w skład pro-kariotycznych rybosomów wchodzą podjednostki 50S i 30S.Eukariotyczne mRNA posiada charakterystyczną sekwencjęczapeczki na 5’-końcu i niemal we wszystkich przypadkachkoduje tylko jedno białko. Prokariotyczne mRNA posiadasekwencję „Shine-Dalgarno” i może służyć jako matryca dosyntezy wielu białek. Różnice występują niemal na każdymetapie biosyntezy białka.Najważniejsza z różnic, dotycząca terminacji translacji,polega na tym, że w komórkach drożdżyS. cerevisiaeeRF1 ieRF3 występują jako heterodimer, co wykazano w układachin vivoiin vitro[9,17,18]. Tymczasem uE. coliRF3 nie wiążesię stabilnie do RF1 lub RF2 [19].Ponadto, u Eukaryota nie udało się zidentyfikować dotej pory homologa prokariotycznego czynnika RRF, którymoże brać udział w translacji cytoplazmatycznej. Natomiastu archebakterii nie udało się zidentyfikować dotychczas ho-mologa eRF3 [1]. Wykazano, że jednoczesna nadekspresjagenów kodujących eRF1 (SUP45) i eRF3 (SUP35) powodujewzrost wydajności terminacji u drożdżyS. cervisiae[9], pod-czas gdy nadekspresja pojedynczego genu kodującego RF1,RF2 lub RF3 jest wystarczająca do powstawania antysupre-sorowego fenotypu uE. coli[20].Brak RF1 i RF2 powoduje, że czynnik RF3 jest aktywnąGTP-azą w rybosomie bakteryjnym [21], podczas gdy eRF3do aktywności GTP-azy potrzebuje obecności eRF1 [22].Może to wiązać się z tworzeniem funkcjonalnego komplek-su eRF1 z eRF3 [9,17]. Ponadto, delecja genuSUP35,kodu-jącego eRF3 uS. cerevisiae,jest letalna w przeciwieństwie doczynnika RF3, który nie jest niezbędny do życia komórkibakteryjnej. Nadprodukcja samego eRF1 w układzie ko-mórek ssaków obniża efekt „readtrough”, spowodowanysupresorowym tRNA, tym samym wykazuje aktywność an-tysupresorową [23].TRANSLACJA W MITOCHONDRIACHW porównaniu z przedstawioną prokariotyczną i euka-riotyczą terminacją translacji jeszcze mniej wiadomo o tymprocesie w organellach. Jak dotąd wszystko wskazuje na to,Postępy Biochemii 53 (4) 2007423mających zaburzony wzrost na niefermentowalnych źró-dłach węgla. Analiza genetyczna u innych organizmów jestznacznie utrudniona.BUDOWA CZYNNIKóW TERMINACYJNYCHW układzie prokariotycznym występują dwa czynnikiterminacji translacji RF1 oraz RF2, rozpoznające odpowied-nio kodony: UAA, UAG oraz UAA i UGA [27]. Wykazująone 40% podobieństwa sekwencji reszt aminokwasowych imożna wyróżnić w nich cztery domeny. W dwóch różnychdomenach zawarte są ważne funkcjonalnie motywy. Pierw-szy motyw jest zlokalizowany w domenie II i odpowiadaza rozpoznanie kodonu stop. Dla czynników RF1 i RF2 uE. colisą to odpowiednio sekwencje PAT i SPF [28]. Miejscate znaleziono poprzez wymiany pomiędzy RF1 i RF2 frag-mentów domen oraz odcinka 24 reszt aminokwasowych,zawierającego „antykodon”. Genetyczne eksperymentywykazały, że jest możliwa zmiana specyficzności RF1 i RF2poprzez wymianę motywu trójaminokwasowego PAT i SPFpomiędzy czynnikami, odpowiednio RF1 i RF2 [28]. Możeto wskazywać na to, iż trójaminokwasowy „antykodon”jest zaangażowany w bezpośrednie rozpoznawanie kodo-nu stop. Ponadto, wykazano, że pojedyncza zmiana amino-kwasowa, w odległości 40 aminokwasów od „antykodonu”w RF2 (E167K), pozwala na terminację translacji ze wszyst-kich trzech kodonów stop [18].Zmieniano sekwencję „antykodonu”, podstawiając podmotywy PAT i SPF inne aminokwasy i badano wpływ narozpoznawanie kodonów stop. Na podstawie dyskrymina-cji oddziaływań postawiono hipotezę, że te trójaminokwa-sowe sekwencje mogą rozróżniać drugi i trzeci nukleotydkodonu stop [28]. Hipotezę tę potwierdza fakt, iż prokario-tyczny RF2 może byćin vitrowiązany poprzez światło UVdo kodonu stop, posiadającego fotoaktywną 4-tiourydynę(s4U) oraz do nukleotydów położonych poniżej i powyżej.Może to wskazywać, że RF2 ma bezpośredni kontakt z sy-gnałem terminacji [29].Drugie, zachowane w ewolucji miejsce, występujące wewszystkich czynnikach terminacyjnych grupy pierwszej,znajduje się w domenie III. Jest to motyw GGQ, związanyz aktywnością hydrolityczną czynników terminacyjnych.Zmiany aminokwasowe w miejscu GGQ znacznie redukująaktywność hydrolityczną czynników RF i wpływają na wią-zanie się ich do rybosomu. Nie wpływają one na rozpozna-wanie kodonu stop u Eukaryota [2,30,31]. Podobna sytuacjajest u Prokaryota, z tym że nie wykazano wpływu zmianyaminokwasowej w miejscu GGQ na wiązanie do rybosomu[6,32]. Zasadniczo, tylko podstawienie reszty glutaminy ubakterii powoduje zachowanie części aktywnościin vitro,ale niein vivo.Mutacjein vivow miejscu GGQ są letalne [32].Wykazano, że glutamina w zachowawczym motywie GGQw czynnikachE. coliRF1 i RF2 (i drożdżowym czynnikumitochondrialnym mRF1) jest metylowana w pozycji N-5[33]. Brak takiej modyfikacji uE. coliwpływa na kilkukrot-ne obniżenie aktywności uwalnianiain vitropeptydu przezczynnik RF2, ale nie przez RF1.Eukaryota i archebakterie posiadają pojedynczy czyn-nik rozpoznający kodon stop w terminacji translacji,nazywany odpowiednio eRF1 i aRF1. Czynniki tych or-ganizmów są bardzo podobne do siebie, ale różnią siępod względem sekwencji i wielkości od czynników bak-teryjnych [2]. Eukariotyczny czynnik terminacji trans-lacji eRF1 zbudowany jest z trzech domen o podobnejwielkości. Domena I zawiera motywy NIKS i YXCXXXF,odpowiedzialne za rozpoznawanie kodonu stop [34,35].Domena III posiada, zachowany w ewolucji, motywGGQ. W miejscu GGQ, odpowiedzialnym za hydrolizęwiązania peptyd-tRNA, glutamina jest metylowana wpozycji N-5 [33]. Mutacje w miejscu kodującym motywGGQ w eRF1 sąin vivośmiertelne dla komórek. W ukła-dziein vitrozmutowane białko jest w stanie rozpoznaćkodon stop, ale nie potrafi katalizować uwolnienia pep-tydu [30]. Domena II odpowiada za wiązanie eRF3.Miejsce odpowiedzialne za wiązanie eRF3 zlokalizowa-no dokładnie w czynniku eRF1 zS. pombe.Delecja jedena-stu C-końcowych reszt aminokwasowych eRF1 zS. pombepoważnie uszkadzała stabilne wiązanie z eRF3, lecz nadalumożliwiała, po ekspresji z plazmidu skróconej formyeRF1, komplementację temperaturowrażliwej mutacjisup45uS. cerevisiae[18].Mitochondrialny czynnik terminacji translacji mRF1składa się z czterech domen. Wykazuje homologię doprokariotycznych czynników terminacji translacji. Po-dobieństwo drożdżowego mRF1 do RF1E. coliwynosi38% (w pewnych obszarach do 79%). Najbardziej wy-raźną homologię sekwencji obserwuje się w centralnej iC–końcowej części mRF1, szczególnie w odcinku 43 ami-nokwasów, między pozycją 280 i 322 mRF1 (domena III).Poprzez porównanie sekwencji aminokwasowych mRF1z RF1 i RF2, można było przewidzieć występowaniedwóch motywów: pierwszego motywu PST (domena II),odpowiedzialnego za rozpoznawanie kodonu stop, orazdrugiego - ściśle zachowanego w ewolucji motywu GGQ(domena III), odpowiedzialnego za hydrolizę wiązaniapeptyd-tRNA [36].Pierwsza, o nieznacznej homologii domena, zawierają-ca α-helisy, jest dłuższa o 47 reszt aminokwasowych odprokariotycznych czynników terminacyjnych i tworzysekwencję kierującą do mitochondriów. Podobnie jak do-mena I, domena IV nie zawiera sekwencji zachowanychw ewolucji i nie znaleziono w niej istotnych motywów.Przeprowadzono ekspresję drożdżowego genuMRF1wE. colii wykazano, że białko kodowane przez ten gen wiążesięin vitrodo rybosomów mitochondrialnych z drożdży ido rybosomówE. colioraz posiada aktywność czynnika ter-minacji translacji [37].RODZAJE, OTOCZENIE I WYBóR KODONóW STOPWykazano, że otoczenie kodonu stop istotnie wpływana możliwość jego odczytania. Uważa się, że nukleotydy,które są poniżej (-) [38] i powyżej (+) [39] kodonu stopmogą wpływać na wydajność terminacji. U Eukaryotai Prokaryota sygnał terminacyjny zawiera dodatkowoważny nukleotyd w pozycji +4 [1].424www.postepybiochemii.plzanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl hannaeva.xlx.pl