Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
Tom 58 2009
Numer 1–2 (282–283)
Strony 135–142
E
wa
w
ójcik
, E
lżbiEta
S
malEc
, k
arolina
G
óral
Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt
Akademia Podlaska
B. Prusa 14, 08-110 Siedlce
e-mail: wojcik@ap.siedlce.pl
esmalec@ap.siedlce.pl
mala.cz@interia.pl
ŁAMLIWE MIEJSCA CHROMOSOMU
Mutacje są źródłem zmienności genetycz-
nej i dlatego są nierozerwalnie związane ze
zmianami ewolucyjnymi, obserwowanymi
wśród organizmów żywych. Mają one cha-
rakter spontaniczny, przypadkowy i bezwa-
runkowy, i wtedy większość z nich jest nie-
korzystna dla organizmu. Mutacje mogą po-
wstawać również pod wpływem czynników
mutagennych, czyli mogą być indukowane
przez człowieka.
Jednym z rodzajów mutacji są aberracje
chromosomowe, związane z naruszeniem bu-
dowy chromosomu, wywołujące dziedziczne
zmiany cech organizmu. Do tej kategorii na-
leżą miejsca łamliwe chromosomu, widocz-
ne jako jego złamania i przerwy (D
EbackEr
i
k
ooy
2007).
Łamliwość chromosomów prowadzi do
zmienności trudnej do przewidzenia. Może
powodować powstawanie wad rozwojowych,
wysoką śmiertelność we wczesnym okresie
życia, osłabienie żywotności zwierząt (D
aniE
-
lak
-c
zEch
i S
łota
2004), a także ekspansje
nowotworów (o
hta
i współaut. 1996).
MIEJSCA ŁAMLIWE
Termin „łamliwe miejsce” (ang. fragile
chromosome site) użył po raz pierwszy Ma-
genis w 1970 r. do opisania powtarzających
się złamań na długim ramieniu chromosomu
16 człowieka, segregujących się w mendlow-
ski sposób (patrz
Durkin
i G
lovEr
2007). W
kolejnych latach ujawniono dodatkowe miej-
sca łamliwe, zlokalizowane w chromosomie
Xq28 (Lubs 1969, Giraud i współaut. 1976,
Harvey i współaut. 1977, Turner i współaut.
1978; patrz
Durkin
i G
lovEr
2007). Ekspresję
miejsca łamliwego na chromosomie X powią-
zano z umysłowym upośledzeniem. Uzyskane
w przeszłości wyniki badań i odkrycia doty-
czące lokalizacji miejsc łamliwych przyczy-
niły się do ekspansji badań w tej dziedzinie
(
Durkin
i G
lovEr
2007).
Miejsca łamliwe, to miejsca, w których
chromosomy wykazują zwiększoną częstość
złamań i przerw (b
al
2006). Są klasyfiko-
wane jako rzadko występujące (S
uthErlanD
i r
icharDS
1999, S
uthErlanD
2003) lub
pospolite (z
lotorynSki
i współaut. 2003,
S
chwarz
i współaut. 2006), w zależności od
częstości występowania w populacji. Miej-
sca łamliwe typu rzadkiego mają charakter
dziedziczny i występują w populacji incy-
dentalnie. Z kolei pospolite miejsca łamliwe
uznawane są za powszechnie występujące w
genomie danego gatunku. Ich liczba może
się wahać w szerokim zakresie (Ś
witońSki
i współaut. 2006). Badania niestabilności
chromosomów wykazały, że zwiększona czę-
stość występowania miejsc łamliwych na-
stępuje w określonych i specyficznych wa-
runkach hodowli
in vitro
lub po indukcji
określonymi związkami chemicznymi (b
al
2006).
136
E
wa
w
ójcik
i współaut.
Loci
łamliwych miejsc określane są lite-
rami „FRA”, po których następuje określenie
poszczególnego chromosomu i konkretne-
go łamliwego miejsca na tym chromosomie,
oznaczonego kolejną literą. Na przykład FRA-
XA odnosi się do łamliwego miejsca A na
chromosomie X; jest to rzadkie, wrażliwe na
brak kwasu foliowego, łamliwe miejsce zwią-
zane z syndromem łamliwego chromosomu
X (n
ational
l
ibrary
o
f
m
EDicinE
).
Regiony genomu, skłonne do niestabilno-
ści i przestawień są przypuszczalnie szkodli-
we dla organizmu i podlegają selekcji podczas
rozwoju. Fakt, że miejsca łamliwe utrzymują
się w genomie organizmów od drożdży do
człowieka sugeruje, że mają one do spełnienia
ważne funkcje w komórce (a
rlt
i współaut.
2006). Pełnią ważną rolę w organizacji wyż-
szej struktury chromosomu oraz w procesie
replikacji. Łamliwe miejsca są najpóźniej repli-
kowane podczas S-fazy cyklu komórkowego i
są sygnałem dla komórki o zakończeniu repli-
kacji. Czynniki kontrolujące cykl komórki mo-
nitorują te miejsca blokując wejście w mitozę
do momentu, kiedy powielanie tych fragmen-
tów nie zostanie ukończone. Wówczas rola
łamliwych miejsc w regulacji cyklu zostaje
zakończona i w większości są one destabilizo-
wane poprzez zniszczenie genów kontrolują-
cych cykl (a
rlt
i współaut. 2006).
Z obserwacji prowadzonych przez G
E
-
rickE
(1999) wynika, że wzrost łamliwości
chromosomu wiąże się z zaburzeniami zacho-
wań u ludzi. Autor wyjaśnia wspólną teorię,
dotyczącą możliwego znaczenia modyfikacji
wyższej struktury DNA w koordynacji funkcji
genu w ewolucji mózgu i podczas rozwoju.
Cytogenetyczne niestabilności, przejawiają-
ce się jako łamliwe miejsca chromosomów,
miejsca wymiany chromatyd siostrzanych,
przemieszczenia, duplikacje, delecje i odwró-
cenia, prowadzą do zaburzeń zachowania
psychicznego, powstawania zmian neurode-
generacyjnych (G
ErickiE
2006), a także z za-
burzeń procesów rozmnażania i reprodukcji
(D
aniElak
-c
zEch
i S
łota
2004). Badania cy-
togenetycznych niestabilności na poziomie
chromatyny pozwalają na identyfikację regio-
nu regulującego procesy epigenetyczne (G
E
-
rickE
2006).
Łamliwe miejsca obserwowane w mikro-
skopie świetlnym jako niezabarwione dziury,
przerwy lub silne przewężenia w chromo-
somach metafazowych, sugerują anormalną
strukturę chromatyny. Identyfikacji łamli-
wych miejsc chromosomu dokonuje się na
trzech poziomach organizacji chromatyny:
— badając zdolność DNA pochodzącą od
łamliwych miejsc do kształtowania nukleoso-
mów, zasadniczych strukturalnych elemen-
tów chromosomów,
— badając układ struktury nukleosomów
powyżej łamliwych miejsc i ekspresji łamli-
wych miejsc w liniach komórek,
— wizualizując łamliwe miejsca w wyższej
strukturze chromatyny.
Łamliwe miejsca związane ze strukturą
chromatyny odgrywają aktywną rolę w pro-
cesach metabolicznych DNA takich jak: repli-
kacja, transkrypcja, naprawa i rekombinacja,
które są blisko połączone z niestabilnością
łamliwych miejsc (w
anG
2006).
Przerwy nie zawsze pojawiają się przy-
padkowo. Zdarzają się w niewielu specyficz-
nych miejscach na chromosomach, kiedy
komórki są najbardziej podatne na uszkodze-
nia, podczas etapów w cyklu komórkowym,
gdy DNA jest kopiowany albo replikowany
i komórka rozdziela się na dwie identyczne
(siostrzane) komórki (a
rbor
2002). Regiony
łamliwych miejsc chromosomu występujące
powszechnie i rzadko zawierają pewną ilość
genów mikroRNA (miRNA) (c
alin
i współ-
aut. 2004). D
urkin
i G
lovEr
(2007), mapując
małe niekodujące geny miRNA na regiony
chromosomów, zidentyfikowali łamliwe miej-
sca. Stwierdzili, że ze 186 genów miRNA, ja-
kie rozpatrywali w badaniach, więcej niż po-
łowa mapowanych genów zawierało znane
łamliwe miejsca, zarówno typu rzadkiego, jak
i występujących powszechnie.
MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU RZADKIEGO
Rzadkie łamliwe miejsca, które są obser-
wowane w populacji w mniej niż 5%, segre-
gowane są w mendlowski sposób. Zwiększe-
nie liczby złamań w tych położeniach jest naj-
częściej spowodowane wzrostem powtórzeń
nukleotydowych (D
urkin
i G
lovEr
2007).
Ich występowanie wiąże się zazwyczaj z na-
gromadzeniem powtórzeń 3-nukleotydowych
(często CCG). Mają one charakter dziedzicz-
ny. Dziedziczą się jak prosta mendlowska ce-
cha kodominująca (k
inG
i S
tanSSfiElD
2002).
U człowieka klasycznym przykładem jest ze-
spół łamliwego chromosomu X, a głównym
objawem klinicznym tej choroby jest upośle-
dzenie umysłowe. Jest to najczęściej występu-
jąca postać dziedzicznego upośledzenia umy-
słowego u mężczyzn (Ryc. 1). Dziedziczenie
tej choroby sprzężone jest z chromosomem
płci X (P
aSSarGE
2004).
Rzadkie łamliwe miejsca są pogrupowa-
ne zgodnie z czynnikami, które wywołują je
Łamliwe miejsca chromosomu
137
Miejsce łamliwe
Ryc. 1. Zespół łamliwe-
go chromosomu X (m
E
-
DicinE
w
orlD
2007).
podczas trwania hodowli tkankowej (D
ur
-
kin
i G
lovEr
2007). Łamliwe miejsca typu
rzadkiego ujawniają się w trakcie trwania
procesu hodowli limfocytów w medium po-
zbawionym kwasu foliowego lub z niskim
poziomem tymidyny (S
uthErlanD
2003).
Główną grupą rzadkich łamliwych miejsc są
te, wrażliwe na brak kwasu foliowego (ang.
folate sensitive), połączone z rozszerzeniem
powtórzeń CGG. Grupa ta obejmuje FRAXA,
w genie
FMR1
, który jest odpowiedzialny za
syndrom łamliwego chromosomu X i FRAXE
w genie
FMR2
, odpowiedzialnego za opóź-
nienie umysłowe. Autosomalne „folate sen-
sitive” łamliwe miejsce w
locus
FRA12A, w
genie
DIP2B
także połączono z opóźnieniem
umysłowym. Pozostałe rzadkie łamliwe miej-
sca, obojętne na brak kwasu foliowego (ang.
nonfolate sensitive), charakteryzujące się roz-
przestrzenionymi powtórzeniami bogatymi
w pary AT, są wywoływane przez BrdU (5-
bromo-2’deoksyurydyna) albo distamycynę-A.
Zawierają one
loci
FRA10B i FRA16B, w któ-
rych allele z bardzo rozprzestrzenionymi po-
wtórzeniami 42- i 33-bp AT minisatelitarnymi
są wyrażane jako łamliwe miejsca (D
urkin
i
G
lovEr
2007). Siedem z wrażliwych na brak
kwasu foliowego (FRA10A, FRA11B, FRA12A,
FRA16A, FRAXA, FRAXE i FRAXF) i dwa z
obojętnych na brak kwasu foliowego (FRA-
10B i FRA16B)
loci
łamliwych miejsc, zostały
scharakteryzowane pod względem molekular-
nym (l
ukuSa
i f
rynS
2008). Opóźniona repli-
kacja jest charakterystyczną cechą rzadkich
łamliwych miejsc. Po raz pierwszy pokazana
została w łamliwym chromosomie X umiej-
scowionym w genie
FMRl
, a później w
loci
FRAXE, FRA16B, i FRA10B. Prawdopodob-
nym wyjaśnieniem opóźnionej replikacji w
rzadkich łamliwych miejscach jest ekspansja
znalezionych w tych miejscach powtórzeń
CGG i AT, mogących tworzyć drugorzędowe
struktury, takie jak spinki, które blokują po-
stęp na widełkach replikacyjnych (D
urkin
i
G
lovEr
2007).
MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU POSPOLITEGO
Pospolite łamliwe miejsca (CFSs), które
są obserwowane u wszystkich gatunków ssa-
ków: kotów, psów, świń, koni, krów, jeleni,
szczurów, czy myszy stanowią największą
klasę łamliwych miejsc (G
lowEr
i współaut.
2005). W odróżnieniu do rzadkich łamliwych
miejsc, CFSs reprezentują składnik normal-
nej struktury chromosomu i nie są wynikiem
powtórzeń nukleotydowych (D
urkin
i G
lo
-
vEr
2007). Uznawane są one za powszechnie
występujące w genomie danego gatunku, ale
ich liczba może się wahać w szerokim zakre-
sie. Ujawnienie się miejsc łamliwych pospoli-
tych może być skorelowane z kancerogenezą
(Ś
witońSki
i współaut. 2006).
Miejsca łamliwe występujące powszech-
nie są zazwyczaj stabilne w komórkach soma-
tycznych. Gdy poddaje się je działaniu inhibi-
torów replikacji w warunkach hodowlanych,
łamliwe miejsca przejawiają rożne cechy nie-
stabilności DNA, takie jak: przerwy, złamania,
przegrupowania (G
lovEr
2006). Afidioko-
lina (inhibitor polimerazy DNA — APH) lub
bromodeoksyurydyna, a także 5-azacytydyna
(5-AZA) indukują miejsca łamliwe pospolite
(Ś
witońSki
i współaut. 2006). Inne inhibitory
indukcji, np. hydroksymocznik, są mniej spe-
138
E
wa
w
ójcik
i współaut.
cyficzne w indukowaniu defektów, zwłaszcza
w łamliwych miejscach, prawdopodobnie z
powodu różnic w mechanizmach hamowania
replikacji (a
rlt
i współaut. 2003, 2006).
Pospolite miejsca łamliwe, to duże re-
giony niestabilności genomu, które można
znaleźć u wszystkich organizmów. Są one
gorącymi miejscami, gdzie następuje reorga-
nizacja chromosomu i często dochodzi do
delecji. Pewna liczba tych łamliwych miejsc
została znaleziona i obejmuje geny, które są
kodowane przez bardzo duże regiony geno-
mu (S
mith
i współaut. 2007). Model miejsc
CFSs oparty jest na bazie opóźnionej albo
wstrzymywanej replikacji, roli w strukturze
sekwencji białek, które kontrolują przebieg
transkrypcji w stabilności łamliwych miejsc.
Sekwencja w łamliwych miejscach stwarza
trudności w replikacji, dalej jest wstrzymy-
wana przez afidiokolinę i pewne inne formy
obciążające replikację. Niezupełna replikacja
w tych miejscach może prowadzić do chro-
mosomowych przerw i złamań albo „ekspre-
sji” łamliwych miejsc (a
rlt
i współaut. 2006,
G
lovEr
2006, P
ichiorri
i współaut. 2008).
Le Beau i współaut. (1984) obserwowali
spóźnioną replikację łamliwych miejsc CFSs
i jako pierwsi pokazali, że sekwencja w FRA-
3B powielana jest bardzo późno i jest do-
datkowym wynikiem działania APH, a w re-
zultacie znacząco opóźnionej replikacji, bo
w około 16,5%
locus
FRA3B w stosunku do
pozostałych niereplikowanych fragmentów
w fazie G2 (patrz D
urkin
i G
lovEr
2007).
Badania nad regulacją replikacji w CFSs,
FRA16D i FRA7H, wskazują, że
loci
te mogą
także mieć trudności w postępie widełek
replikacyjnych. Autorzy opracowali model,
w którym regiony CFS inicjują replikację
poprawnie, ale są powolne w ukończeniu
tego procesu, dlatego w sąsiedztwie miejsc
niereplikowanego DNA dochodzi do łama-
nia się chromosomu. Ta spóźniona replika-
cja w CFSs może, podobnie jak w rzadkich
łamliwych miejscach, wynikać z formowania
drugorzędowych struktur, które opóźniają
postęp widełek replikacyjnych, albo może
wynikać z innych czynników, które wpływa-
ją na dynamikę replikacji w tych regionach
(D
urkin
i G
lovEr
2007).
W ostatnich latach znacznie wzrosła wie-
dza o genomowej strukturze CFSs i komór-
kowych mechanizmach kontrolujących ich
stabilność. Badania CFSs pozwoliły na powią-
zanie czynników transkrypcyjnych komórki
i naprawy DNA, z wielorakimi białkami tego
cyklu, które uczestniczą w stabilności CFS
(D
urkin
i G
lovEr
2007, P
ichiorri
i współ-
aut. 2008), np:
— ATR — ataksja-telangiektazja i związana
z Rad3, kinaza (a
rlt
i współaut. 2003);
— BRCA1
— ludzki gen supresorowy znaj-
dujący się na długim ramieniu 17 chromo-
somu w
locus
17q21 (m
iki
1994), ekspresja
zmutowanego
BRCA1
osłabia kontrolę w
punkcie kontrolnym fazy G2/M (l
arSon
i
współaut. 1997);
— CHK1 — (ang. checkpoint kinaze), ho-
molog kinazy cyklu komórkowego u drożdży
(a
rlt
i
współaut. 2003);
— RAD51
— homolog prokariotycznego
genu
RecA e. coli
, który jest ulokowany na
długim ramieniu (q) na chromosomie 15
(a
rlt
i współaut. 2006), mutacje w tym ge-
nie prowadzą do zwiększenia liczby podwój-
nych złamań (S
hinohara
i współaut. 1992).
W 2002 r. Glover i współautorzy z Medi-
cal School i Howard Hughes Medical Institu-
te odkryli (patrz a
rbor
2002), że białko ATR
chroni łamliwe miejsca od złamania podczas
replikacji DNA. ATR reguluje sygnały działa-
nia kilku ważnych białek w łańcuchu, które
kontrolują replikację w komórce. Kiedy re-
plikacja przeciąga się, ATR wysyła chemicz-
ny sygnał „mówiący” komórce o zatrzymaniu
replikacji do momentu, gdy zostanie ziden-
tyfikowany problem. Ponadto a
rbor
(2002)
cytując pracę Casper (2002) podaje, że duży
poziom afidiokoliny w komórce bez ATR w
warunkach hodowlanych powoduje większą
liczbę złamań. Złamania w łamliwych miej-
scach były od 5. do10. razy liczniejsze w po-
równaniu do normalnych komórek. Nieule-
gające replikacji regiony mogą stymulować
w fazie S i/albo G2/M aktywację czynników
transkrypcyjnych, w których ATR gra klu-
czową rolę. Jednak identyfikacja łamliwych
miejsc na metafazowych chromosomach su-
geruje, że duża liczba tych defektów może
umknąć kontroli czynników transkrypcyj-
nych. Delecje albo translokacje w łamliwych
miejscach mogą wynikać z podwójnych zła-
mań nici DNA, spowodowanych uszkodze-
niami już osłabionego regionu na pojedyn-
czej nici albo anormalnego procesu łączenia
przerw przy uszkodzonych widełkach (G
lo
-
vEr
2006).
Ekspresja cytogenetyczna CFS ujawnia
się w określonych warunkach stresu replika-
cyjnego. CFSs służą jako ,,podpisy” w stresie
replikacyjnym co w konsekwencji pozwala
zrozumieć mechanizm niestabilności geno-
mu w normalnej i nowotworowej komórce
(D
urkin
i G
lovEr
2007).
Łamliwe miejsca chromosomu
139
ŁAMLIWOŚĆ CHROMOSOMÓW A KANCEROGENEZA
Niestabilność genetyczna, chromosomo-
wa i mikrosatelitarna jest jedną z charakte-
rystycznych cech komórek nowotworowych.
W komórkach nowotworowych niestabilność
chromosomowa wyraża się nagromadzeniem
aberracji strukturalnych i liczbowych chro-
mosomów (S
ąSiaDEk
i współaut. 2003). Do-
niesienia naukowców przedstawiają coraz
więcej dowodów na to, że istnieje związek
pomiędzy miejscami łamliwymi i chorobą
nowotworową. Badacze znajdują złamania
i przerwy w chromosomach w komórkach
rakowych (S
EPPa
1998). Łamliwe miejsca i
związane z nimi geny są często tracone lub
przegrupowywane w wielu komórkach no-
wotworowych (G
lovEr
2006). Obserwowa-
ne delecje w komórkach rakowych biorą
się z nieodpowiednich albo wadliwych ho-
mologicznych napraw blokowanych widełek
i mogą być wzmacniane przez mutacje w
punkcie kontrolnym replikacji.
Odkrycie różnych typów naturalnych
łamliwych miejsc w chromosomach drożdży
i charakterystyka związanych z nimi delecji,
duplikacji i translokacji, ujawnia potencjalne
mechanizmy łamliwości i wynikającej z niej
reorganizacji chromosomu. Zrozumienie me-
chanizmu zapewni wgląd w powstawanie no-
wotworu. Delecje oraz reorganizacja w łamli-
wych miejscach typu CFSs i powiązane geny
supresorowe są pierwotnymi efektami w
genezie nowotworów (f
rEuDEnrEich
2007).
D
urkin
i G
lovEr
(2007) w komórkach hodo-
wanych
in vitro
stwierdzili, że CFSs są gorą-
cymi miejscami dla przerw i złamań w chro-
mosomach metafazowych i powodują reorga-
nizację chromosomu. Bazując na tej charakte-
rystyce oraz związku CFSs i punktów złamań
w zespolonych chromosomach, pewna ilość
wcześniejszych prac sugeruje, że CFSs mogą
być odpowiedzialne za niektóre reorganiza-
cje chromosomów zaobserwowane w nowo-
tworach. Jednakże ich prawdziwe biologicz-
ne znaczenie i udział w reorganizacji chro-
mosomu w nowotworach komórki nie były
jasne, dopóki nie sklonowano pewnej ilości
CFSs. Chociaż CFSs nie są zaangażowane w
często powtarzającą się translokację w raku
i białaczce, liczne badania pokazały, że CFSs
są miejscami częstych delecji i innych chro-
mosomowych reorganizacji w komórkach
guzów.
W przeciwieństwie do normalnych ko-
mórek, badania wskazują, że łamliwe miej-
sca są identyfikowane z częstymi złamaniami
i przestawieniami w komórkach rakowych
(m
atSuyama
i współaut. 2004). Większość
badań skupiało się na sekwencjach FRA3B/
FHIT (ang. fragile histidine triad) i FRA16D/
WWOX (ang. WW domain-containing oxido-
reductase), ponieważ są one dwoma najczę-
ściej ulegającymi ekspresji i najbardziej cha-
rakterystycznymi łamliwymi miejscami i oby-
dwa leżą w obrębie licznych genów supreso-
rowych (m
atSuyama
i współaut. 2004, a
rlt
i współaut. 2006, k
uroki
i współaut. 2006,
P
ichiorri
i współaut. 2008). FRA3B często
wykazuje utratę alleli albo homozygotyczne
delecje w wielu typach nowotworów, np.
zlokalizowanych w płucach, przewodzie po-
karmowyn, nerce czy klatce piersiowej (a
rlt
i współaut. 2006).
ATR reguluje sygnały działania kilku róż-
nych ważnych białek, kontrolujących repli-
kację w komórce (a
rbor
2002). Komórki
z białkiem BRCA1 mają dużą liczbę miejsc
wykazujących niestabilności chromosomo-
we (v
Enkitaraman
2002). Mutacje w genie
BRCA1
powiększają m.in. ryzyko raka piersi
(n
aroD
i współaut. 2000).
Łamliwe miejsca, defekty w replikacji
DNA lub dysfunkcja telomeru mogą pobu-
dzać amplifikację genów w nowotworach
(a
lbErtSon
2006). Sekwencje telomerów
mogą wpływać na aberracje chromosomowe
(b
oufflEr
1998). Dowiedziono, iż struktura
telomeru ma znaczenie w regulowaniu sta-
bilności genomu, starzeniu się komórki i po-
wstawaniu nowotworów (D
Elany
i współaut.
2003). Identyfikacja łamliwych miejsc jest
drogą do wyjaśnienia mechanizmu kancero-
genezy, ponieważ łamliwość w określonych
miejscach chromosomu może być przyczyną
tworzenia się nowotworu (t
ai
i współaut.
1998, S
chwarz
i współaut. 2006).
ZACHOWANIE W EWOLUCJI
Znajdowane łamliwe miejsca u ludzi, na-
czelnych, myszy, a nawet drożdży skłoniło
Glovera (2002) (patrz a
rbor
2002) do zada-
nia retorycznego pytania: „Skoro są to okoli-
ce DNA skłonne do złamań i trudne do re-
plikacji, to dlaczego zachowywały się one
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl hannaeva.xlx.pl
Numer 1–2 (282–283)
Strony 135–142
E
wa
w
ójcik
, E
lżbiEta
S
malEc
, k
arolina
G
óral
Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt
Akademia Podlaska
B. Prusa 14, 08-110 Siedlce
e-mail: wojcik@ap.siedlce.pl
esmalec@ap.siedlce.pl
mala.cz@interia.pl
ŁAMLIWE MIEJSCA CHROMOSOMU
Mutacje są źródłem zmienności genetycz-
nej i dlatego są nierozerwalnie związane ze
zmianami ewolucyjnymi, obserwowanymi
wśród organizmów żywych. Mają one cha-
rakter spontaniczny, przypadkowy i bezwa-
runkowy, i wtedy większość z nich jest nie-
korzystna dla organizmu. Mutacje mogą po-
wstawać również pod wpływem czynników
mutagennych, czyli mogą być indukowane
przez człowieka.
Jednym z rodzajów mutacji są aberracje
chromosomowe, związane z naruszeniem bu-
dowy chromosomu, wywołujące dziedziczne
zmiany cech organizmu. Do tej kategorii na-
leżą miejsca łamliwe chromosomu, widocz-
ne jako jego złamania i przerwy (D
EbackEr
i
k
ooy
2007).
Łamliwość chromosomów prowadzi do
zmienności trudnej do przewidzenia. Może
powodować powstawanie wad rozwojowych,
wysoką śmiertelność we wczesnym okresie
życia, osłabienie żywotności zwierząt (D
aniE
-
lak
-c
zEch
i S
łota
2004), a także ekspansje
nowotworów (o
hta
i współaut. 1996).
MIEJSCA ŁAMLIWE
Termin „łamliwe miejsce” (ang. fragile
chromosome site) użył po raz pierwszy Ma-
genis w 1970 r. do opisania powtarzających
się złamań na długim ramieniu chromosomu
16 człowieka, segregujących się w mendlow-
ski sposób (patrz
Durkin
i G
lovEr
2007). W
kolejnych latach ujawniono dodatkowe miej-
sca łamliwe, zlokalizowane w chromosomie
Xq28 (Lubs 1969, Giraud i współaut. 1976,
Harvey i współaut. 1977, Turner i współaut.
1978; patrz
Durkin
i G
lovEr
2007). Ekspresję
miejsca łamliwego na chromosomie X powią-
zano z umysłowym upośledzeniem. Uzyskane
w przeszłości wyniki badań i odkrycia doty-
czące lokalizacji miejsc łamliwych przyczy-
niły się do ekspansji badań w tej dziedzinie
(
Durkin
i G
lovEr
2007).
Miejsca łamliwe, to miejsca, w których
chromosomy wykazują zwiększoną częstość
złamań i przerw (b
al
2006). Są klasyfiko-
wane jako rzadko występujące (S
uthErlanD
i r
icharDS
1999, S
uthErlanD
2003) lub
pospolite (z
lotorynSki
i współaut. 2003,
S
chwarz
i współaut. 2006), w zależności od
częstości występowania w populacji. Miej-
sca łamliwe typu rzadkiego mają charakter
dziedziczny i występują w populacji incy-
dentalnie. Z kolei pospolite miejsca łamliwe
uznawane są za powszechnie występujące w
genomie danego gatunku. Ich liczba może
się wahać w szerokim zakresie (Ś
witońSki
i współaut. 2006). Badania niestabilności
chromosomów wykazały, że zwiększona czę-
stość występowania miejsc łamliwych na-
stępuje w określonych i specyficznych wa-
runkach hodowli
in vitro
lub po indukcji
określonymi związkami chemicznymi (b
al
2006).
136
E
wa
w
ójcik
i współaut.
Loci
łamliwych miejsc określane są lite-
rami „FRA”, po których następuje określenie
poszczególnego chromosomu i konkretne-
go łamliwego miejsca na tym chromosomie,
oznaczonego kolejną literą. Na przykład FRA-
XA odnosi się do łamliwego miejsca A na
chromosomie X; jest to rzadkie, wrażliwe na
brak kwasu foliowego, łamliwe miejsce zwią-
zane z syndromem łamliwego chromosomu
X (n
ational
l
ibrary
o
f
m
EDicinE
).
Regiony genomu, skłonne do niestabilno-
ści i przestawień są przypuszczalnie szkodli-
we dla organizmu i podlegają selekcji podczas
rozwoju. Fakt, że miejsca łamliwe utrzymują
się w genomie organizmów od drożdży do
człowieka sugeruje, że mają one do spełnienia
ważne funkcje w komórce (a
rlt
i współaut.
2006). Pełnią ważną rolę w organizacji wyż-
szej struktury chromosomu oraz w procesie
replikacji. Łamliwe miejsca są najpóźniej repli-
kowane podczas S-fazy cyklu komórkowego i
są sygnałem dla komórki o zakończeniu repli-
kacji. Czynniki kontrolujące cykl komórki mo-
nitorują te miejsca blokując wejście w mitozę
do momentu, kiedy powielanie tych fragmen-
tów nie zostanie ukończone. Wówczas rola
łamliwych miejsc w regulacji cyklu zostaje
zakończona i w większości są one destabilizo-
wane poprzez zniszczenie genów kontrolują-
cych cykl (a
rlt
i współaut. 2006).
Z obserwacji prowadzonych przez G
E
-
rickE
(1999) wynika, że wzrost łamliwości
chromosomu wiąże się z zaburzeniami zacho-
wań u ludzi. Autor wyjaśnia wspólną teorię,
dotyczącą możliwego znaczenia modyfikacji
wyższej struktury DNA w koordynacji funkcji
genu w ewolucji mózgu i podczas rozwoju.
Cytogenetyczne niestabilności, przejawiają-
ce się jako łamliwe miejsca chromosomów,
miejsca wymiany chromatyd siostrzanych,
przemieszczenia, duplikacje, delecje i odwró-
cenia, prowadzą do zaburzeń zachowania
psychicznego, powstawania zmian neurode-
generacyjnych (G
ErickiE
2006), a także z za-
burzeń procesów rozmnażania i reprodukcji
(D
aniElak
-c
zEch
i S
łota
2004). Badania cy-
togenetycznych niestabilności na poziomie
chromatyny pozwalają na identyfikację regio-
nu regulującego procesy epigenetyczne (G
E
-
rickE
2006).
Łamliwe miejsca obserwowane w mikro-
skopie świetlnym jako niezabarwione dziury,
przerwy lub silne przewężenia w chromo-
somach metafazowych, sugerują anormalną
strukturę chromatyny. Identyfikacji łamli-
wych miejsc chromosomu dokonuje się na
trzech poziomach organizacji chromatyny:
— badając zdolność DNA pochodzącą od
łamliwych miejsc do kształtowania nukleoso-
mów, zasadniczych strukturalnych elemen-
tów chromosomów,
— badając układ struktury nukleosomów
powyżej łamliwych miejsc i ekspresji łamli-
wych miejsc w liniach komórek,
— wizualizując łamliwe miejsca w wyższej
strukturze chromatyny.
Łamliwe miejsca związane ze strukturą
chromatyny odgrywają aktywną rolę w pro-
cesach metabolicznych DNA takich jak: repli-
kacja, transkrypcja, naprawa i rekombinacja,
które są blisko połączone z niestabilnością
łamliwych miejsc (w
anG
2006).
Przerwy nie zawsze pojawiają się przy-
padkowo. Zdarzają się w niewielu specyficz-
nych miejscach na chromosomach, kiedy
komórki są najbardziej podatne na uszkodze-
nia, podczas etapów w cyklu komórkowym,
gdy DNA jest kopiowany albo replikowany
i komórka rozdziela się na dwie identyczne
(siostrzane) komórki (a
rbor
2002). Regiony
łamliwych miejsc chromosomu występujące
powszechnie i rzadko zawierają pewną ilość
genów mikroRNA (miRNA) (c
alin
i współ-
aut. 2004). D
urkin
i G
lovEr
(2007), mapując
małe niekodujące geny miRNA na regiony
chromosomów, zidentyfikowali łamliwe miej-
sca. Stwierdzili, że ze 186 genów miRNA, ja-
kie rozpatrywali w badaniach, więcej niż po-
łowa mapowanych genów zawierało znane
łamliwe miejsca, zarówno typu rzadkiego, jak
i występujących powszechnie.
MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU RZADKIEGO
Rzadkie łamliwe miejsca, które są obser-
wowane w populacji w mniej niż 5%, segre-
gowane są w mendlowski sposób. Zwiększe-
nie liczby złamań w tych położeniach jest naj-
częściej spowodowane wzrostem powtórzeń
nukleotydowych (D
urkin
i G
lovEr
2007).
Ich występowanie wiąże się zazwyczaj z na-
gromadzeniem powtórzeń 3-nukleotydowych
(często CCG). Mają one charakter dziedzicz-
ny. Dziedziczą się jak prosta mendlowska ce-
cha kodominująca (k
inG
i S
tanSSfiElD
2002).
U człowieka klasycznym przykładem jest ze-
spół łamliwego chromosomu X, a głównym
objawem klinicznym tej choroby jest upośle-
dzenie umysłowe. Jest to najczęściej występu-
jąca postać dziedzicznego upośledzenia umy-
słowego u mężczyzn (Ryc. 1). Dziedziczenie
tej choroby sprzężone jest z chromosomem
płci X (P
aSSarGE
2004).
Rzadkie łamliwe miejsca są pogrupowa-
ne zgodnie z czynnikami, które wywołują je
Łamliwe miejsca chromosomu
137
Miejsce łamliwe
Ryc. 1. Zespół łamliwe-
go chromosomu X (m
E
-
DicinE
w
orlD
2007).
podczas trwania hodowli tkankowej (D
ur
-
kin
i G
lovEr
2007). Łamliwe miejsca typu
rzadkiego ujawniają się w trakcie trwania
procesu hodowli limfocytów w medium po-
zbawionym kwasu foliowego lub z niskim
poziomem tymidyny (S
uthErlanD
2003).
Główną grupą rzadkich łamliwych miejsc są
te, wrażliwe na brak kwasu foliowego (ang.
folate sensitive), połączone z rozszerzeniem
powtórzeń CGG. Grupa ta obejmuje FRAXA,
w genie
FMR1
, który jest odpowiedzialny za
syndrom łamliwego chromosomu X i FRAXE
w genie
FMR2
, odpowiedzialnego za opóź-
nienie umysłowe. Autosomalne „folate sen-
sitive” łamliwe miejsce w
locus
FRA12A, w
genie
DIP2B
także połączono z opóźnieniem
umysłowym. Pozostałe rzadkie łamliwe miej-
sca, obojętne na brak kwasu foliowego (ang.
nonfolate sensitive), charakteryzujące się roz-
przestrzenionymi powtórzeniami bogatymi
w pary AT, są wywoływane przez BrdU (5-
bromo-2’deoksyurydyna) albo distamycynę-A.
Zawierają one
loci
FRA10B i FRA16B, w któ-
rych allele z bardzo rozprzestrzenionymi po-
wtórzeniami 42- i 33-bp AT minisatelitarnymi
są wyrażane jako łamliwe miejsca (D
urkin
i
G
lovEr
2007). Siedem z wrażliwych na brak
kwasu foliowego (FRA10A, FRA11B, FRA12A,
FRA16A, FRAXA, FRAXE i FRAXF) i dwa z
obojętnych na brak kwasu foliowego (FRA-
10B i FRA16B)
loci
łamliwych miejsc, zostały
scharakteryzowane pod względem molekular-
nym (l
ukuSa
i f
rynS
2008). Opóźniona repli-
kacja jest charakterystyczną cechą rzadkich
łamliwych miejsc. Po raz pierwszy pokazana
została w łamliwym chromosomie X umiej-
scowionym w genie
FMRl
, a później w
loci
FRAXE, FRA16B, i FRA10B. Prawdopodob-
nym wyjaśnieniem opóźnionej replikacji w
rzadkich łamliwych miejscach jest ekspansja
znalezionych w tych miejscach powtórzeń
CGG i AT, mogących tworzyć drugorzędowe
struktury, takie jak spinki, które blokują po-
stęp na widełkach replikacyjnych (D
urkin
i
G
lovEr
2007).
MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU POSPOLITEGO
Pospolite łamliwe miejsca (CFSs), które
są obserwowane u wszystkich gatunków ssa-
ków: kotów, psów, świń, koni, krów, jeleni,
szczurów, czy myszy stanowią największą
klasę łamliwych miejsc (G
lowEr
i współaut.
2005). W odróżnieniu do rzadkich łamliwych
miejsc, CFSs reprezentują składnik normal-
nej struktury chromosomu i nie są wynikiem
powtórzeń nukleotydowych (D
urkin
i G
lo
-
vEr
2007). Uznawane są one za powszechnie
występujące w genomie danego gatunku, ale
ich liczba może się wahać w szerokim zakre-
sie. Ujawnienie się miejsc łamliwych pospoli-
tych może być skorelowane z kancerogenezą
(Ś
witońSki
i współaut. 2006).
Miejsca łamliwe występujące powszech-
nie są zazwyczaj stabilne w komórkach soma-
tycznych. Gdy poddaje się je działaniu inhibi-
torów replikacji w warunkach hodowlanych,
łamliwe miejsca przejawiają rożne cechy nie-
stabilności DNA, takie jak: przerwy, złamania,
przegrupowania (G
lovEr
2006). Afidioko-
lina (inhibitor polimerazy DNA — APH) lub
bromodeoksyurydyna, a także 5-azacytydyna
(5-AZA) indukują miejsca łamliwe pospolite
(Ś
witońSki
i współaut. 2006). Inne inhibitory
indukcji, np. hydroksymocznik, są mniej spe-
138
E
wa
w
ójcik
i współaut.
cyficzne w indukowaniu defektów, zwłaszcza
w łamliwych miejscach, prawdopodobnie z
powodu różnic w mechanizmach hamowania
replikacji (a
rlt
i współaut. 2003, 2006).
Pospolite miejsca łamliwe, to duże re-
giony niestabilności genomu, które można
znaleźć u wszystkich organizmów. Są one
gorącymi miejscami, gdzie następuje reorga-
nizacja chromosomu i często dochodzi do
delecji. Pewna liczba tych łamliwych miejsc
została znaleziona i obejmuje geny, które są
kodowane przez bardzo duże regiony geno-
mu (S
mith
i współaut. 2007). Model miejsc
CFSs oparty jest na bazie opóźnionej albo
wstrzymywanej replikacji, roli w strukturze
sekwencji białek, które kontrolują przebieg
transkrypcji w stabilności łamliwych miejsc.
Sekwencja w łamliwych miejscach stwarza
trudności w replikacji, dalej jest wstrzymy-
wana przez afidiokolinę i pewne inne formy
obciążające replikację. Niezupełna replikacja
w tych miejscach może prowadzić do chro-
mosomowych przerw i złamań albo „ekspre-
sji” łamliwych miejsc (a
rlt
i współaut. 2006,
G
lovEr
2006, P
ichiorri
i współaut. 2008).
Le Beau i współaut. (1984) obserwowali
spóźnioną replikację łamliwych miejsc CFSs
i jako pierwsi pokazali, że sekwencja w FRA-
3B powielana jest bardzo późno i jest do-
datkowym wynikiem działania APH, a w re-
zultacie znacząco opóźnionej replikacji, bo
w około 16,5%
locus
FRA3B w stosunku do
pozostałych niereplikowanych fragmentów
w fazie G2 (patrz D
urkin
i G
lovEr
2007).
Badania nad regulacją replikacji w CFSs,
FRA16D i FRA7H, wskazują, że
loci
te mogą
także mieć trudności w postępie widełek
replikacyjnych. Autorzy opracowali model,
w którym regiony CFS inicjują replikację
poprawnie, ale są powolne w ukończeniu
tego procesu, dlatego w sąsiedztwie miejsc
niereplikowanego DNA dochodzi do łama-
nia się chromosomu. Ta spóźniona replika-
cja w CFSs może, podobnie jak w rzadkich
łamliwych miejscach, wynikać z formowania
drugorzędowych struktur, które opóźniają
postęp widełek replikacyjnych, albo może
wynikać z innych czynników, które wpływa-
ją na dynamikę replikacji w tych regionach
(D
urkin
i G
lovEr
2007).
W ostatnich latach znacznie wzrosła wie-
dza o genomowej strukturze CFSs i komór-
kowych mechanizmach kontrolujących ich
stabilność. Badania CFSs pozwoliły na powią-
zanie czynników transkrypcyjnych komórki
i naprawy DNA, z wielorakimi białkami tego
cyklu, które uczestniczą w stabilności CFS
(D
urkin
i G
lovEr
2007, P
ichiorri
i współ-
aut. 2008), np:
— ATR — ataksja-telangiektazja i związana
z Rad3, kinaza (a
rlt
i współaut. 2003);
— BRCA1
— ludzki gen supresorowy znaj-
dujący się na długim ramieniu 17 chromo-
somu w
locus
17q21 (m
iki
1994), ekspresja
zmutowanego
BRCA1
osłabia kontrolę w
punkcie kontrolnym fazy G2/M (l
arSon
i
współaut. 1997);
— CHK1 — (ang. checkpoint kinaze), ho-
molog kinazy cyklu komórkowego u drożdży
(a
rlt
i
współaut. 2003);
— RAD51
— homolog prokariotycznego
genu
RecA e. coli
, który jest ulokowany na
długim ramieniu (q) na chromosomie 15
(a
rlt
i współaut. 2006), mutacje w tym ge-
nie prowadzą do zwiększenia liczby podwój-
nych złamań (S
hinohara
i współaut. 1992).
W 2002 r. Glover i współautorzy z Medi-
cal School i Howard Hughes Medical Institu-
te odkryli (patrz a
rbor
2002), że białko ATR
chroni łamliwe miejsca od złamania podczas
replikacji DNA. ATR reguluje sygnały działa-
nia kilku ważnych białek w łańcuchu, które
kontrolują replikację w komórce. Kiedy re-
plikacja przeciąga się, ATR wysyła chemicz-
ny sygnał „mówiący” komórce o zatrzymaniu
replikacji do momentu, gdy zostanie ziden-
tyfikowany problem. Ponadto a
rbor
(2002)
cytując pracę Casper (2002) podaje, że duży
poziom afidiokoliny w komórce bez ATR w
warunkach hodowlanych powoduje większą
liczbę złamań. Złamania w łamliwych miej-
scach były od 5. do10. razy liczniejsze w po-
równaniu do normalnych komórek. Nieule-
gające replikacji regiony mogą stymulować
w fazie S i/albo G2/M aktywację czynników
transkrypcyjnych, w których ATR gra klu-
czową rolę. Jednak identyfikacja łamliwych
miejsc na metafazowych chromosomach su-
geruje, że duża liczba tych defektów może
umknąć kontroli czynników transkrypcyj-
nych. Delecje albo translokacje w łamliwych
miejscach mogą wynikać z podwójnych zła-
mań nici DNA, spowodowanych uszkodze-
niami już osłabionego regionu na pojedyn-
czej nici albo anormalnego procesu łączenia
przerw przy uszkodzonych widełkach (G
lo
-
vEr
2006).
Ekspresja cytogenetyczna CFS ujawnia
się w określonych warunkach stresu replika-
cyjnego. CFSs służą jako ,,podpisy” w stresie
replikacyjnym co w konsekwencji pozwala
zrozumieć mechanizm niestabilności geno-
mu w normalnej i nowotworowej komórce
(D
urkin
i G
lovEr
2007).
Łamliwe miejsca chromosomu
139
ŁAMLIWOŚĆ CHROMOSOMÓW A KANCEROGENEZA
Niestabilność genetyczna, chromosomo-
wa i mikrosatelitarna jest jedną z charakte-
rystycznych cech komórek nowotworowych.
W komórkach nowotworowych niestabilność
chromosomowa wyraża się nagromadzeniem
aberracji strukturalnych i liczbowych chro-
mosomów (S
ąSiaDEk
i współaut. 2003). Do-
niesienia naukowców przedstawiają coraz
więcej dowodów na to, że istnieje związek
pomiędzy miejscami łamliwymi i chorobą
nowotworową. Badacze znajdują złamania
i przerwy w chromosomach w komórkach
rakowych (S
EPPa
1998). Łamliwe miejsca i
związane z nimi geny są często tracone lub
przegrupowywane w wielu komórkach no-
wotworowych (G
lovEr
2006). Obserwowa-
ne delecje w komórkach rakowych biorą
się z nieodpowiednich albo wadliwych ho-
mologicznych napraw blokowanych widełek
i mogą być wzmacniane przez mutacje w
punkcie kontrolnym replikacji.
Odkrycie różnych typów naturalnych
łamliwych miejsc w chromosomach drożdży
i charakterystyka związanych z nimi delecji,
duplikacji i translokacji, ujawnia potencjalne
mechanizmy łamliwości i wynikającej z niej
reorganizacji chromosomu. Zrozumienie me-
chanizmu zapewni wgląd w powstawanie no-
wotworu. Delecje oraz reorganizacja w łamli-
wych miejscach typu CFSs i powiązane geny
supresorowe są pierwotnymi efektami w
genezie nowotworów (f
rEuDEnrEich
2007).
D
urkin
i G
lovEr
(2007) w komórkach hodo-
wanych
in vitro
stwierdzili, że CFSs są gorą-
cymi miejscami dla przerw i złamań w chro-
mosomach metafazowych i powodują reorga-
nizację chromosomu. Bazując na tej charakte-
rystyce oraz związku CFSs i punktów złamań
w zespolonych chromosomach, pewna ilość
wcześniejszych prac sugeruje, że CFSs mogą
być odpowiedzialne za niektóre reorganiza-
cje chromosomów zaobserwowane w nowo-
tworach. Jednakże ich prawdziwe biologicz-
ne znaczenie i udział w reorganizacji chro-
mosomu w nowotworach komórki nie były
jasne, dopóki nie sklonowano pewnej ilości
CFSs. Chociaż CFSs nie są zaangażowane w
często powtarzającą się translokację w raku
i białaczce, liczne badania pokazały, że CFSs
są miejscami częstych delecji i innych chro-
mosomowych reorganizacji w komórkach
guzów.
W przeciwieństwie do normalnych ko-
mórek, badania wskazują, że łamliwe miej-
sca są identyfikowane z częstymi złamaniami
i przestawieniami w komórkach rakowych
(m
atSuyama
i współaut. 2004). Większość
badań skupiało się na sekwencjach FRA3B/
FHIT (ang. fragile histidine triad) i FRA16D/
WWOX (ang. WW domain-containing oxido-
reductase), ponieważ są one dwoma najczę-
ściej ulegającymi ekspresji i najbardziej cha-
rakterystycznymi łamliwymi miejscami i oby-
dwa leżą w obrębie licznych genów supreso-
rowych (m
atSuyama
i współaut. 2004, a
rlt
i współaut. 2006, k
uroki
i współaut. 2006,
P
ichiorri
i współaut. 2008). FRA3B często
wykazuje utratę alleli albo homozygotyczne
delecje w wielu typach nowotworów, np.
zlokalizowanych w płucach, przewodzie po-
karmowyn, nerce czy klatce piersiowej (a
rlt
i współaut. 2006).
ATR reguluje sygnały działania kilku róż-
nych ważnych białek, kontrolujących repli-
kację w komórce (a
rbor
2002). Komórki
z białkiem BRCA1 mają dużą liczbę miejsc
wykazujących niestabilności chromosomo-
we (v
Enkitaraman
2002). Mutacje w genie
BRCA1
powiększają m.in. ryzyko raka piersi
(n
aroD
i współaut. 2000).
Łamliwe miejsca, defekty w replikacji
DNA lub dysfunkcja telomeru mogą pobu-
dzać amplifikację genów w nowotworach
(a
lbErtSon
2006). Sekwencje telomerów
mogą wpływać na aberracje chromosomowe
(b
oufflEr
1998). Dowiedziono, iż struktura
telomeru ma znaczenie w regulowaniu sta-
bilności genomu, starzeniu się komórki i po-
wstawaniu nowotworów (D
Elany
i współaut.
2003). Identyfikacja łamliwych miejsc jest
drogą do wyjaśnienia mechanizmu kancero-
genezy, ponieważ łamliwość w określonych
miejscach chromosomu może być przyczyną
tworzenia się nowotworu (t
ai
i współaut.
1998, S
chwarz
i współaut. 2006).
ZACHOWANIE W EWOLUCJI
Znajdowane łamliwe miejsca u ludzi, na-
czelnych, myszy, a nawet drożdży skłoniło
Glovera (2002) (patrz a
rbor
2002) do zada-
nia retorycznego pytania: „Skoro są to okoli-
ce DNA skłonne do złamań i trudne do re-
plikacji, to dlaczego zachowywały się one