Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
13.
WŁASNO
Ś
CI I SKŁAD
KWASÓW
NUKLEINOWYCH
1. Preparatyka kwasów nukleinowych z dro
Ŝ
d
Ŝ
y
Zasada:
W komórce – zarówno w j
ą
drze, jak i w cytoplazmie – wi
ę
kszo
ść
kwasów nu-
kleinowych wyst
ę
puje w formie nukleoprotein. Izolowanie takich poł
ą
cze
ń
wy-
maga zastosowania łagodnej procedury ekstrakcyjnej, poniewa
Ŝ
pod wpływem
st
ęŜ
onych soli nukleoproteiny dysocjuj
ą
na kwas nukleinowy i białka. Opisana
poni
Ŝ
ej preparatyka kwasów nukleinowych z dro
Ŝ
d
Ŝ
y polega na rozbiciu komó-
rek oraz usuni
ę
ciu białek z ekstraktu za pomoc
ą
anionowego detergentu siar-
czanu dodecylu sodu (SDS), który jednocze
ś
nie hamuje aktywno
ść
rybonukleaz
(dzi
ę
ki denaturacji białek). Kwasy nukleinowe wytr
ą
ca si
ę
z ekstraktu za pomo-
c
ą
etanolu. W komórkach dro
Ŝ
d
Ŝ
y wi
ę
kszo
ść
kwasów nukleinowych stanowi
ą
kwasy rybonukleinowe, natomiast DNA nie osi
ą
ga 2% całkowitej zawarto
ś
ci
kwasów nukleinowych. Zastosowana metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych
z tego materiału biologicznego (dro
Ŝ
d
Ŝ
y) pozwala otrzyma
ć
preparaty, które
przede wszystkim zawieraj
ą
RNA o wysokiej masie cz
ą
steczkowej. Preparaty te
charakteryzuj
ą
si
ę
nisk
ą
zawarto
ś
ci
ą
DNA (około 0,5%) oraz stosunkowo ni-
skim stopniem zanieczyszczenia białkami (do 2% preparatu).
Wykonanie:
·
W zlewce ogrza
ć
do wrzenia 55 ml 6% roztworu SDS na płytce elektrycznej,
stale mieszaj
ą
c. Doda
ć
25 g rozdrobnionych dro
Ŝ
d
Ŝ
y piekarskich i dalej
ogrzewa
ć
przez 1 minut
ę
. Przenie
ść
zlewk
ę
z ekstraktem z płytki elektrycznej
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrzewa
ć
nast
ę
pne 2 minuty, stale mieszaj
ą
c. Eks-
trakt schłodzi
ć
do temperatury 4
0
C, po czym wirowa
ć
przy 3000 obr./min
przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej.
·
Supernatant (płyn znad osadu) zla
ć
do cylindra miarowego, zmierzy
ć
obj
ę
-
to
ść
, po czym wla
ć
do dwóch obj
ę
to
ś
ci ozi
ę
bionego w lodzie 95% etanolu.
Po upływie 5 minut odwirowa
ć
osad wytr
ą
conego kwasu nukleinowego,
w warunkach opisanych powy
Ŝ
ej. Osad rozpu
ś
ci
ć
w 10 ml 0,1 M NaOH.
Roztwór nukleinianu zachowa
ć
do nast
ę
pnych
ć
wicze
ń
.
7
2. Rozpuszczalno
ść
kwasów nukleinowych
Zasada:
Kwasy nukleinowe maj
ą
charakter polianionowy, wynikaj
ą
cy z bogactwa reszt
fosforanowych w ich strukturze, dzi
ę
ki którym maj
ą
odczyn kwasowy. Dlatego
wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczaj
ą
si
ę
w roztworach zasadowych,
natomiast słabo w rozcie
ń
czonych kwasach i w wodzie. Kwasy nukleinowe
w wodnych roztworach tworz
ą
koloidy, z których łatwo mo
Ŝ
na je wytr
ą
ci
ć
od-
czynnikami odwadniaj
ą
cymi, np. etanolem, który jest powszechnie wykorzy-
stywany w metodach izolacyjnych do oczyszczania kwasów nukleinowych.
Wykonanie:
·
Do 0,5 ml roztworu 0,1% nukleinianu dodawa
ć
kroplami 0,1 M HCl a
Ŝ
do
wytr
ą
cenia osadu kwasu nukleinowego. Nast
ę
pnie doda
ć
kroplami 1 M
NaOH, a
Ŝ
do ponownego rozpuszczenia osadu.
·
Do 0,5 ml roztworu nukleinianu doda
ć
1 ml 95% etanolu. Zaobserwowa
ć
wytr
ą
canie si
ę
osadu kwasu nukleinowego.
3. Hydroliza kwasowa RNA
Zasada:
Wykrywanie obecno
ś
ci kwasów nukleinowych w materiale biologicznym opie-
ra si
ę
na ich wielkocz
ą
steczkowym charakterze, charakterystycznych własno-
ś
ciach absorbowania
ś
wiatła UV oraz na analizie jako
ś
ciowej składu kwasów
nukleinowych. Wi
ę
kszo
ść
charakterystycznych reakcji dla poszczególnych
składników kwasów nukleinowych, zachodzi dopiero po hydrolizie makrocz
ą
-
steczki na składniki proste. W tym celu nale
Ŝ
y przeprowadzi
ć
hydroliz
ę
che-
miczn
ą
kwasu nukleinowego. DNA jest odporne na działanie mocnych zasad,
pozostawiony w roztworze 1M NaOH przez 20–40 godz. w temp. 37
0
C nie do-
starcza
Ŝ
adnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA roz-
pada si
ę
całkowicie do mieszaniny 2
’
- i 3
’
-monofosfonukleozydów. Mo
Ŝ
liwe
jest to dzi
ę
ki obecno
ś
ci grupy –OH przy atomie C2
'
rybozy, która w
ś
rodowisku
zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwałych cyklicznych nukleozydo-2
’
,3
’
-
-fosforanów, rozpadaj
ą
cych si
ę
z równym prawdopodobie
ń
stwem do nukleozy-
do-2
’
- i nukleozydo-3
’
-fosforanów. Brak grupy –OH przy atomie C2
'
deoksyry-
bozy uniemo
Ŝ
liwia powstanie cyklicznych fosforanów nukleozydów podczas
hydrolizy zasadowej DNA i jest to przyczyn
ą
oporno
ś
ci kwasów deoksyrybo-
nukleinowych na działanie zasad, dlatego DNA hydrolizuje si
ę
w
ś
rodowisku
kwasowym. Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza ró
Ŝ
nych pro-
8
duktów zale
Ŝ
nie od st
ęŜ
enia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy
i temperatury. Wi
ą
zania glikozydowe ró
Ŝ
ni
ą
si
ę
wra
Ŝ
liwo
ś
ci
ą
na działanie kwa-
sów, tzn. w nukleotydach purynowych wi
ą
zania glikozydowe s
ą
bardziej la-
bilne ni
Ŝ
w nukleotydach pirymidynowych. Dlatego krótkotrwałe ogrzewanie
(w 100
0
C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o małych st
ęŜ
eniach
(ok. 1 M) dostarcza pocz
ą
tkowo kwasów apurynowych, które s
ą
ła
ń
cuchami
polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych, a dopiero w dalszym
etapie hydrolizy (po 1 godz.) dostarcza mononukleotydów pirymidynowych,
pentoz i kwasu fosforowego. Natomiast pod działaniem mocnych kwasów mi-
neralnych (np. 72% roztwór HClO
4
) i w podwy
Ŝ
szonej temperaturze (100
0
C
przez 1 godz.) z obu typów kwasów nukleinowych nast
ę
puje uwolnienie zasad
purynowych i pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego.
Wykonanie:
·
Do probówki odmierzy
ć
5 ml nukleinianu z dro
Ŝ
d
Ŝ
y, doda
ć
10 ml 10% H
2
SO
4
i ogrzewa
ć
we wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat
zachowa
ć
do nast
ę
pnych
ć
wicze
ń
.
3.1. Wykazanie obecno
ś
ci puryn
Zasada:
Zasady azotowe reaguj
ą
z jonami Ag
+
(lub Cu
+
), tworz
ą
c nierozpuszczalne sole
kompleksowe.
Wykonanie:
·
Do 1 ml hydrolizatu nukleinianu doda
ć
st
ęŜ
onego amoniaku do odczynu lekko
alkalicznego, ocenionego papierkiem wska
ź
nikowym. Roztwór przes
ą
czy
ć
,
je
ś
li nie jest klarowny. Do klarownego przes
ą
czu doda
ć
0,3 ml 1% roztworu
AgNO
3
. Wytr
ą
ca si
ę
osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amo-
niaku.
3.2. Wykazanie obecno
ś
ci kwasu fosforowego
Zasada:
Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecno
ś
ci HNO
3
, w wy-
niku czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu,
Ŝ
ółto zabar-
wiony osad.
9
Wykonanie:
·
Do 0,5 ml hydrolizatu nukleinianu doda
ć
st
ęŜ
onego amoniaku do odczynu
oboj
ę
tnego, ocenionego papierkiem wska
ź
nikowym. Nast
ę
pnie doda
ć
0,5 ml
st
ęŜ
onego HNO
3
, po czym 2 ml 5% roztworu molibdenianu amonu. Probów-
k
ę
z prób
ą
wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrza
ć
do wrzenia. Podczas
ogrzewania pojawia si
ę
Ŝ
ółty fosfomolibdenian amonu, co jest dowodem,
Ŝ
e
w hydrolizacie był kwas fosforowy.
4. Odró
Ŝ
nianie DNA od RNA
Nukleotydy buduj
ą
ce DNA zawieraj
ą
2
’
-deoksy-D-ryboz
ę
, a RNA D-ryboz
ę
.
Istnienie ró
Ŝ
nych pentoz jest podstaw
ą
chemicznego odró
Ŝ
niania preparatu
DNA od RNA.
4.1. Wykrywanie DNA metod
ą
Dischego
Zasada:
W
ś
rodowisku kwa
ś
nym (st
ęŜ
onego H
2
SO
4
i CH
3
COOH) deoksyryboza (wolna
i zwi
ą
zana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloamin
ą
produkt kon-
densacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest konsekwencj
ą
powstania
aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwa-
su siarkowego i octowego.
H O C H
2
O
O H
d e o ks yryb o za
O H
C H
3
C O O H
H
2
S O
4
H
O
C
H
C H
2
+
N
k o m p le ks b a rw y
n ie b ie s kie j
C H
2
C
O
d ife n ylo am in a
C H
2
O H
n
a ld e h yd
h yd ro ks yle w u lin o w y
ω
-
10
Nast
ę
pnie aldehyd ten kondensuje z difenyloamin
ą
, tworz
ą
c produkt o barwie
niebieskiej, którego maksimum absorpcji przypada przy długo
ś
ci fali 600 nm.
Oprócz deoksyrybozy reakcj
ę
t
ę
daje tak
Ŝ
e kwas N-acetyloneuraminowy. Po-
wstały produkt w
ś
rodowisku oboj
ę
tnym lub zasadowym ma barw
ę
Ŝ
ółt
ą
. De-
oksyryboza zwi
ą
zana z zasadami pirymidynowymi i ryboza nie daj
ą
tego od-
czynu.
Wykonanie:
·
Przygotowa
ć
w statywie 4 probówki. Do ka
Ŝ
dej z nich odmierzy
ć
po 0,5 ml
roztworów, odpowiednio: kwasu nukleinowego nr 1 do pierwszej, kwasu nu-
kleinowego nr 2 do drugiej, deoksyrybozy do trzeciej i wody destylowanej do
czwartej (próba
ś
lepa).
Do wszystkich probówek wprowadzi
ć
po 1 ml odczynnika Dischego (1% di-
fenyloamina w H
2
SO
4
i CH
3
COOH lodowaty) i wymiesza
ć
.
· Probówki z analizowanymi próbami wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrze-
wa
ć
przez 10 minut.
·
Zinterpretowa
ć
uzyskane wyniki, wyja
ś
ni
ć
, która próba kwasu nukleinowego
jest roztworem DNA.
4.2. Wykrywanie RNA metod
ą
orcynow
ą
Zasada:
Wolne pentozy, fosfopentozy, jak te
Ŝ
zwi
ą
zane w nukleotydach purynowych
(lecz nie pirymidynowych) w kwasach nukleinowych podczas ogrzewania ze
st
ęŜ
onym HCl przechodz
ą
w furfural.
HO
OH
HO
O
OH
O
CHO
+ 2
furfural
CH
3
H
2
O
CH
3
CH
3
orcyna
O
barwny kompleks
Powstały furfural tworzy z orcyn
ą
, w obecno
ś
ci katalitycznie działaj
ą
cych jo-
nów Fe
+3
, kompleks o trwałej barwie zielonej, którego maksimum absorpcji
przypada przy długo
ś
ci fali 610 nm. W tych warunkach deoksyryboza reaguje
10-krotnie słabiej od rybozy, dlatego odczyn ten dla DNA wypada ujemnie. Re-
11
·
zanotowane.pl doc.pisz.pl pdf.pisz.pl hannaeva.xlx.pl
WŁASNO
Ś
CI I SKŁAD
KWASÓW
NUKLEINOWYCH
1. Preparatyka kwasów nukleinowych z dro
Ŝ
d
Ŝ
y
Zasada:
W komórce – zarówno w j
ą
drze, jak i w cytoplazmie – wi
ę
kszo
ść
kwasów nu-
kleinowych wyst
ę
puje w formie nukleoprotein. Izolowanie takich poł
ą
cze
ń
wy-
maga zastosowania łagodnej procedury ekstrakcyjnej, poniewa
Ŝ
pod wpływem
st
ęŜ
onych soli nukleoproteiny dysocjuj
ą
na kwas nukleinowy i białka. Opisana
poni
Ŝ
ej preparatyka kwasów nukleinowych z dro
Ŝ
d
Ŝ
y polega na rozbiciu komó-
rek oraz usuni
ę
ciu białek z ekstraktu za pomoc
ą
anionowego detergentu siar-
czanu dodecylu sodu (SDS), który jednocze
ś
nie hamuje aktywno
ść
rybonukleaz
(dzi
ę
ki denaturacji białek). Kwasy nukleinowe wytr
ą
ca si
ę
z ekstraktu za pomo-
c
ą
etanolu. W komórkach dro
Ŝ
d
Ŝ
y wi
ę
kszo
ść
kwasów nukleinowych stanowi
ą
kwasy rybonukleinowe, natomiast DNA nie osi
ą
ga 2% całkowitej zawarto
ś
ci
kwasów nukleinowych. Zastosowana metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych
z tego materiału biologicznego (dro
Ŝ
d
Ŝ
y) pozwala otrzyma
ć
preparaty, które
przede wszystkim zawieraj
ą
RNA o wysokiej masie cz
ą
steczkowej. Preparaty te
charakteryzuj
ą
si
ę
nisk
ą
zawarto
ś
ci
ą
DNA (około 0,5%) oraz stosunkowo ni-
skim stopniem zanieczyszczenia białkami (do 2% preparatu).
Wykonanie:
·
W zlewce ogrza
ć
do wrzenia 55 ml 6% roztworu SDS na płytce elektrycznej,
stale mieszaj
ą
c. Doda
ć
25 g rozdrobnionych dro
Ŝ
d
Ŝ
y piekarskich i dalej
ogrzewa
ć
przez 1 minut
ę
. Przenie
ść
zlewk
ę
z ekstraktem z płytki elektrycznej
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrzewa
ć
nast
ę
pne 2 minuty, stale mieszaj
ą
c. Eks-
trakt schłodzi
ć
do temperatury 4
0
C, po czym wirowa
ć
przy 3000 obr./min
przez 10 minut w wirówce laboratoryjnej.
·
Supernatant (płyn znad osadu) zla
ć
do cylindra miarowego, zmierzy
ć
obj
ę
-
to
ść
, po czym wla
ć
do dwóch obj
ę
to
ś
ci ozi
ę
bionego w lodzie 95% etanolu.
Po upływie 5 minut odwirowa
ć
osad wytr
ą
conego kwasu nukleinowego,
w warunkach opisanych powy
Ŝ
ej. Osad rozpu
ś
ci
ć
w 10 ml 0,1 M NaOH.
Roztwór nukleinianu zachowa
ć
do nast
ę
pnych
ć
wicze
ń
.
7
2. Rozpuszczalno
ść
kwasów nukleinowych
Zasada:
Kwasy nukleinowe maj
ą
charakter polianionowy, wynikaj
ą
cy z bogactwa reszt
fosforanowych w ich strukturze, dzi
ę
ki którym maj
ą
odczyn kwasowy. Dlatego
wolne kwasy nukleinowe dobrze rozpuszczaj
ą
si
ę
w roztworach zasadowych,
natomiast słabo w rozcie
ń
czonych kwasach i w wodzie. Kwasy nukleinowe
w wodnych roztworach tworz
ą
koloidy, z których łatwo mo
Ŝ
na je wytr
ą
ci
ć
od-
czynnikami odwadniaj
ą
cymi, np. etanolem, który jest powszechnie wykorzy-
stywany w metodach izolacyjnych do oczyszczania kwasów nukleinowych.
Wykonanie:
·
Do 0,5 ml roztworu 0,1% nukleinianu dodawa
ć
kroplami 0,1 M HCl a
Ŝ
do
wytr
ą
cenia osadu kwasu nukleinowego. Nast
ę
pnie doda
ć
kroplami 1 M
NaOH, a
Ŝ
do ponownego rozpuszczenia osadu.
·
Do 0,5 ml roztworu nukleinianu doda
ć
1 ml 95% etanolu. Zaobserwowa
ć
wytr
ą
canie si
ę
osadu kwasu nukleinowego.
3. Hydroliza kwasowa RNA
Zasada:
Wykrywanie obecno
ś
ci kwasów nukleinowych w materiale biologicznym opie-
ra si
ę
na ich wielkocz
ą
steczkowym charakterze, charakterystycznych własno-
ś
ciach absorbowania
ś
wiatła UV oraz na analizie jako
ś
ciowej składu kwasów
nukleinowych. Wi
ę
kszo
ść
charakterystycznych reakcji dla poszczególnych
składników kwasów nukleinowych, zachodzi dopiero po hydrolizie makrocz
ą
-
steczki na składniki proste. W tym celu nale
Ŝ
y przeprowadzi
ć
hydroliz
ę
che-
miczn
ą
kwasu nukleinowego. DNA jest odporne na działanie mocnych zasad,
pozostawiony w roztworze 1M NaOH przez 20–40 godz. w temp. 37
0
C nie do-
starcza
Ŝ
adnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA roz-
pada si
ę
całkowicie do mieszaniny 2
’
- i 3
’
-monofosfonukleozydów. Mo
Ŝ
liwe
jest to dzi
ę
ki obecno
ś
ci grupy –OH przy atomie C2
'
rybozy, która w
ś
rodowisku
zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwałych cyklicznych nukleozydo-2
’
,3
’
-
-fosforanów, rozpadaj
ą
cych si
ę
z równym prawdopodobie
ń
stwem do nukleozy-
do-2
’
- i nukleozydo-3
’
-fosforanów. Brak grupy –OH przy atomie C2
'
deoksyry-
bozy uniemo
Ŝ
liwia powstanie cyklicznych fosforanów nukleozydów podczas
hydrolizy zasadowej DNA i jest to przyczyn
ą
oporno
ś
ci kwasów deoksyrybo-
nukleinowych na działanie zasad, dlatego DNA hydrolizuje si
ę
w
ś
rodowisku
kwasowym. Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza ró
Ŝ
nych pro-
8
duktów zale
Ŝ
nie od st
ęŜ
enia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy
i temperatury. Wi
ą
zania glikozydowe ró
Ŝ
ni
ą
si
ę
wra
Ŝ
liwo
ś
ci
ą
na działanie kwa-
sów, tzn. w nukleotydach purynowych wi
ą
zania glikozydowe s
ą
bardziej la-
bilne ni
Ŝ
w nukleotydach pirymidynowych. Dlatego krótkotrwałe ogrzewanie
(w 100
0
C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o małych st
ęŜ
eniach
(ok. 1 M) dostarcza pocz
ą
tkowo kwasów apurynowych, które s
ą
ła
ń
cuchami
polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych, a dopiero w dalszym
etapie hydrolizy (po 1 godz.) dostarcza mononukleotydów pirymidynowych,
pentoz i kwasu fosforowego. Natomiast pod działaniem mocnych kwasów mi-
neralnych (np. 72% roztwór HClO
4
) i w podwy
Ŝ
szonej temperaturze (100
0
C
przez 1 godz.) z obu typów kwasów nukleinowych nast
ę
puje uwolnienie zasad
purynowych i pirymidynowych, pentoz i kwasu fosforowego.
Wykonanie:
·
Do probówki odmierzy
ć
5 ml nukleinianu z dro
Ŝ
d
Ŝ
y, doda
ć
10 ml 10% H
2
SO
4
i ogrzewa
ć
we wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej przez 45 minut. Otrzymany hydrolizat
zachowa
ć
do nast
ę
pnych
ć
wicze
ń
.
3.1. Wykazanie obecno
ś
ci puryn
Zasada:
Zasady azotowe reaguj
ą
z jonami Ag
+
(lub Cu
+
), tworz
ą
c nierozpuszczalne sole
kompleksowe.
Wykonanie:
·
Do 1 ml hydrolizatu nukleinianu doda
ć
st
ęŜ
onego amoniaku do odczynu lekko
alkalicznego, ocenionego papierkiem wska
ź
nikowym. Roztwór przes
ą
czy
ć
,
je
ś
li nie jest klarowny. Do klarownego przes
ą
czu doda
ć
0,3 ml 1% roztworu
AgNO
3
. Wytr
ą
ca si
ę
osad soli srebrowych puryn nierozpuszczalnych w amo-
niaku.
3.2. Wykazanie obecno
ś
ci kwasu fosforowego
Zasada:
Kwas fosforowy reaguje z molibdenianem amonu w obecno
ś
ci HNO
3
, w wy-
niku czego powstaje nierozpuszczalny fosfomolibdenian amonu,
Ŝ
ółto zabar-
wiony osad.
9
Wykonanie:
·
Do 0,5 ml hydrolizatu nukleinianu doda
ć
st
ęŜ
onego amoniaku do odczynu
oboj
ę
tnego, ocenionego papierkiem wska
ź
nikowym. Nast
ę
pnie doda
ć
0,5 ml
st
ęŜ
onego HNO
3
, po czym 2 ml 5% roztworu molibdenianu amonu. Probów-
k
ę
z prób
ą
wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrza
ć
do wrzenia. Podczas
ogrzewania pojawia si
ę
Ŝ
ółty fosfomolibdenian amonu, co jest dowodem,
Ŝ
e
w hydrolizacie był kwas fosforowy.
4. Odró
Ŝ
nianie DNA od RNA
Nukleotydy buduj
ą
ce DNA zawieraj
ą
2
’
-deoksy-D-ryboz
ę
, a RNA D-ryboz
ę
.
Istnienie ró
Ŝ
nych pentoz jest podstaw
ą
chemicznego odró
Ŝ
niania preparatu
DNA od RNA.
4.1. Wykrywanie DNA metod
ą
Dischego
Zasada:
W
ś
rodowisku kwa
ś
nym (st
ęŜ
onego H
2
SO
4
i CH
3
COOH) deoksyryboza (wolna
i zwi
ą
zana w nukleotydach purynowych) tworzy z difenyloamin
ą
produkt kon-
densacji o barwie niebieskiej. Ta barwna reakcja jest konsekwencj
ą
powstania
aldehydu hydroksylewulinowego z deoksyrybozy pod wpływem działania kwa-
su siarkowego i octowego.
H O C H
2
O
O H
d e o ks yryb o za
O H
C H
3
C O O H
H
2
S O
4
H
O
C
H
C H
2
+
N
k o m p le ks b a rw y
n ie b ie s kie j
C H
2
C
O
d ife n ylo am in a
C H
2
O H
n
a ld e h yd
h yd ro ks yle w u lin o w y
ω
-
10
Nast
ę
pnie aldehyd ten kondensuje z difenyloamin
ą
, tworz
ą
c produkt o barwie
niebieskiej, którego maksimum absorpcji przypada przy długo
ś
ci fali 600 nm.
Oprócz deoksyrybozy reakcj
ę
t
ę
daje tak
Ŝ
e kwas N-acetyloneuraminowy. Po-
wstały produkt w
ś
rodowisku oboj
ę
tnym lub zasadowym ma barw
ę
Ŝ
ółt
ą
. De-
oksyryboza zwi
ą
zana z zasadami pirymidynowymi i ryboza nie daj
ą
tego od-
czynu.
Wykonanie:
·
Przygotowa
ć
w statywie 4 probówki. Do ka
Ŝ
dej z nich odmierzy
ć
po 0,5 ml
roztworów, odpowiednio: kwasu nukleinowego nr 1 do pierwszej, kwasu nu-
kleinowego nr 2 do drugiej, deoksyrybozy do trzeciej i wody destylowanej do
czwartej (próba
ś
lepa).
Do wszystkich probówek wprowadzi
ć
po 1 ml odczynnika Dischego (1% di-
fenyloamina w H
2
SO
4
i CH
3
COOH lodowaty) i wymiesza
ć
.
· Probówki z analizowanymi próbami wstawi
ć
do wrz
ą
cej ła
ź
ni wodnej i ogrze-
wa
ć
przez 10 minut.
·
Zinterpretowa
ć
uzyskane wyniki, wyja
ś
ni
ć
, która próba kwasu nukleinowego
jest roztworem DNA.
4.2. Wykrywanie RNA metod
ą
orcynow
ą
Zasada:
Wolne pentozy, fosfopentozy, jak te
Ŝ
zwi
ą
zane w nukleotydach purynowych
(lecz nie pirymidynowych) w kwasach nukleinowych podczas ogrzewania ze
st
ęŜ
onym HCl przechodz
ą
w furfural.
HO
OH
HO
O
OH
O
CHO
+ 2
furfural
CH
3
H
2
O
CH
3
CH
3
orcyna
O
barwny kompleks
Powstały furfural tworzy z orcyn
ą
, w obecno
ś
ci katalitycznie działaj
ą
cych jo-
nów Fe
+3
, kompleks o trwałej barwie zielonej, którego maksimum absorpcji
przypada przy długo
ś
ci fali 610 nm. W tych warunkach deoksyryboza reaguje
10-krotnie słabiej od rybozy, dlatego odczyn ten dla DNA wypada ujemnie. Re-
11
·