123, Szczepionki atenuowane

//-->.pos {position:absolute; z-index: 0; left: 0px; top: 0px;}Tom 542005Numer 1 (266)Strony 123–130LUIZAJEDLINA-PANASIUKInstytut Parazytologii im. W. Stefańskiego PANTwarda 51/55, 00-818 Warszawae-mail: luiza@twarda.pan.plPRÓBY WYKORZYSTANIA SZCZEPIONEK GENETYCZNYCH PRZECIWKO HELMINTOMWSTĘPPojęcie szczepienia pojawiło się ponad200 lat temu, kiedy Jenner, po raz pierwszy,podał wirusa ospy, aby zapobiec powstawa-niu ospy prawdziwej. Przez ostatni wiek, roz-wój i powszechne użycie szczepionek prze-ciwko rozmaitym patogenom był wielkimtriumfem nauk medycznych. Tak wielki po-stęp w tej dziedzinie nie był oczywiście przy-padkowy. Niewątpliwie ogromnie przyczyniłsię do niego burzliwy rozwój, w ciągu ostat-nich 15 lat, nowoczesnych technik biologiimolekularnej. Mimo to, nie ma skutecznejszczepionki przeciw takim ważnym choro-bom pasożytniczym jak: malaria, leiszmanio-za, toksoplazmoza, cryptosporydioza, schisto-somoza czy fascjoloza. Wynika to ze złożono-ści cyklu życiowego i budowy pasożyta orazze złożoności oddziaływań między pasożyta-mi i ich żywicielami. Te czynniki powodują,że skonstruowanie efektywnej szczepionkiprzeciwpasożytniczej jest bardzo trudne.RODZAJE SZCZEPIONEKStosowane obecnie technologie otrzymy-wania antygenów do produkcji swoistychszczepionek przeciwpasożytniczych umożli-wiają ich podział na 4 grupy.SZCZEPIONKI ZAWIERAJĄCE ŻYWE ATENUOWANEPATOGENYprzeciwko chorobom wywoływanym przezpierwotniaki, np. przeciwko toksoplazmozieowiec, kokcydiozie kur (WĘDRYCHOWICZi WI-ŚNIEWSKI2003).SZCZEPIONKI ZAWIERAJĄCE NATYWNE(NATURALNE) ANTYGENYSzczepionki takie zawierają patogenypoddane przypadkowej mutacji, indukowa-nej przez niekorzystne warunki hodowlii długotrwałą selekcję osobników, stale mo-nitorowanych i selekcjonowanych pod ką-tem zachowania antygenów i zmniejszeniaich żywotności. Wywołują one niezwykleważną stymulację miejscową, istotną w po-budzeniu układu odpornościowego błon ślu-zowych. Jednakże ogranicza się stosowanietakich szczepionek, ponieważ istnieje oba-wa odtworzenia inwazyjnej formy patogenu.Na rynku dostępnych jest kilka tego rodzajuszczepionek przeciwpasożytniczych, głównieW skład ich wchodzą wyizolowane an-tygeny, najczęściej powierzchniowe, lubunieszkodliwione egzotoksyny wytwarzaneprzez pasożyty. W tym przypadku dużymproblemem jest uzyskanie wystarczającejilości materiału do szczepienia oraz żmud-ne procedury izolacji i oczyszczania białekantygenowych z organizmu wywołującegochorobę. Do tej pory przetestowano kilkaszczepionek przeciwko inwazjomF. hepaticaopartych na natywnych (naturalnych) biał-kach strukturalnych bądź wydalniczych przy-wry (WĘDRYCHOWICZi KLOCKIEWICZ1994,SPITHILLi DALTON1998). Zachęcające wyniki124LUIZAJEDLINA-PANASIUKotrzymano u bydła zaszczepionego mieszani-ną natywnych katepsyn L1 i L2, gdzie uzyska-no redukcję liczby przywr rozwijających siępo zarażeniu sprawdzającym (ang. challenge)o 55% (MULCAHYi współaut. 1999).SZCZEPIONKI OPARTE NA REKOMBINOWANYCHBIAŁKACH PATOGENUcroplus,oparta na rekombinowanym białkuz jelita tego krwiopijnego stawonoga (WĘ-DRYCHOWICZi WIŚNIEWSKI2003).SZCZEPIONKI Z NAGIEGO DNASklonowanie genu lub cDNA kodującegookreślone białko jest tylko pierwszym z wie-lu kroków niezbędnych do wyprodukowaniazrekombinowanego białka. Drugim etapemjest wprowadzenie genu do komórki go-spodarza, która będzie produkowała to biał-ko. W komórkach bakteryjnych (najczęściejwE coli, Bacillus subtilis),w tani i prostysposób i w dość krótkim czasie można otrzy-mać dużą ilość produktu. Choć okazuje się, żeniektóre białka, eksprymowane na wysokimpoziomie (więcej niż 10% masy wszystkichbiałek bakteryjnych), często ulegają niepra-widłowemu fałdowaniu i odkładane są w for-mie nierozpuszczalnych ciałek inkluzyjnych.Białka po ekstrakcji z tych struktur częstosą biologicznie nieaktywne. Białka otrzymu-je się również w drożdżach(Saccharomycescerevisiae),które są prostymi komórkami eu-kariotycznymi, przypominającymi jednak podwieloma względami komórki ssacze, a ro-sną równie szybko jak komórki bakteryjne.Przeprowadzają również wiele z modyfikacjiposttranslacyjnych charakterystycznych dlaludzkich białek, a także można je pobudzićdo wydzielania białek w medium (pożywki).Za pomocą wektorów bakulowirusowychmożna otrzymać ekspresję heterologicznychbiałek w komórkach owadzich. Ekspresja jestwprawdzie na wysokim poziomie, ale mogąpojawiać się modyfikacje posttranslacyjne,a ponadto koszt tych hodowli jest częstozbyt duży. Na rynku jest dostępna szczepion-ka przeciw inwazjom kleszczaBoophilus mi-Szczepionki te zostały określone jakoszczepionki trzeciej generacji. Są to szcze-pionki zawierające plazmidy ekspresyjnez promotorem eukariotycznym, w którywklonowany jest antygen pasożyta w for-mie cDNA. Białko wytwarzane na jego baziew tkance szczepionego ssaka jest wychwy-tywane przez komórki prezentujące anty-gen, zarówno w kompleksach z cząsteczkamiMHC klasy I, jak i II, zapewniając powsta-nie zarówno odpowiedzi immunologicznejpośredniczonej przez Th1, jak i Th2 (JAKÓ-BISIAKi współaut. 2002). Wyniki wielu eks-perymentów wskazują, że na typ skutecznejodpowiedzi immunologicznej, wywołanejprzez szczepienie DNA, może wpływać wieleczynników, między innymi: rodzaj plazmidu,rodzaj adjuwantu, miejsce i metoda podania,liczba dawek szczepionki, interwał czasowypomiędzy kolejnymi dawkami itp. (KOFTAi WĘDRYCHOWICZ2001). Szczepionki otrzyma-ne metodami rekombinacji DNA są stabilnea ich stosowaniu nie towarzyszą niepożądaneobjawy. Preparaty można stosunkowo szybkomodyfikować do zmian cech patogennegoorganizmu za pomocą immunomodulującychkonstruktów DNA, mogących wywołać od-mienne od naturalnych ochronnych mecha-nizmów odpowiedzi immunologicznej.JAK OTRZYMUJE SIĘ SZCZEPIONKĘ DNA?Ryc. 1. Klonowanie antygenu szczepionkowego.Aby otrzymać szczepionkę DNA, musimywyizolować RNA z danego pasożyta (two-rzenie bibliotek cDNA). Metodą RT-PCR, zapomocą enzymu odwrotnej transkryptazy,otrzymujemy cDNA kodujący antygen szcze-pionkowy, który jest namnażany metodąPCR. Kolejną fazą jest wklejenie cDNA anty-genu do wektora plazmidowego. Wektor, tocząsteczka DNA, będąca nośnikiem interesu-jącej nas sekwencji DNA, która posiada zdol-ność do autonomicznej replikacji w danymtypie komórek. Zapewnia powielanie wpro-wadzonego fragmentu DNA, czyli klonowa-nie (Ryc. 1), a czasami także wydajną synte-zę kodowanego przez gen białka (transkryp-cję i translację oraz jego stabilność) jak mato miejsce w tzw. wektorach ekspresyjnych(Ryc 2). Są różne typy wektorów a dobranieodpowiedniego zależy m.in. od tego, w jakichkomórkach zamierzamy klonować gen. Naj-ważniejszym elementem warunkującym spe-Szczepioneki genetyczne przeciwko helmintom125CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA EFEKTYWNOŚĆIMMUNIZACJIEfektywność działania szczepionek prze-ciwpasożytniczych zależy od wielu czynni-ków. Najważniejsze z nich to: dobór odpo-wiednich antygenów, wybór optymalnej dro-gi podania antygenu, dobór odpowiedniegoprotokołu immunizacji.Wpływ formy antygenu na odpowiedźimmunologicznąRodzaj i intensywność odpowiedzi immu-nologicznej wywoływanej szczepieniem zale-ży w dużej mierze od cech antygenu.Istnieje wiele dowodów eksperymental-nych na to, że antygeny białkowe i podanew formie cDNA, stanowią odmienne „wyzwa-nia” dla układu immunologicznego, zarów-no w zakresie rozpoznania, jak i odpowie-dzi obronnej (KOFTAi WĘDRYCHOWICZ2001,WĘDRYCHOWICZi WIŚNIEWSKI2003). Dla pra-widłowej odpowiedzi niezbędne jest rozpo-znanie przez receptor limfocytu T cząstecz-ki antygenów zgodności tkankowej na po-wierzchni komórki prezentującej antygen lubkomórki docelowej. Muszą one ulec wstęp-nemu przetworzeniu w komórce prezentu-jącej antygen, gdyż limfocyty T nie rozpo-znają natywnych białek pasożyta. Sekwencjaaminokwasów i struktura „przetworzonych”peptydów determinują interakcje kompleksuMHC i receptora TCR limfocytu T. Tylko ści-sła komplementarność struktur, warunkującaich konformację przestrzenną, zapewnia roz-poznanie antygenów i wywołuje odpowiedź.Niektóre peptydy, nawet mające zdolnośćłączenia się z MHC, nie indukują proliferacjikomórek T. Przetwarzane peptydy pasożytasą prezentowane głównie limfocytom T CD8,w kontekście antygenów zgodności tkanko-wej klasy I (obecnych na większości komó-rek organizmu), lub limfocytom T CD4, przyudziale cząsteczek MHC klasy II, znajdują-cych się na wyspecjalizowanych komórkachprezentujących antygen (APC). W zależnościod profilu uwalnianych cytokin wśród limfo-cytów CD4 wyróżniono subpopulacje:— Th1 — produkujące IL-2, interferongamma i TNF, promujące odpowiedź komór-kową;— Th2 — produkujące IL-4, IL-5, IL-6 i IL--10, które wpływają na rozwój limfocytówB i potęgują odpowiedź humoralną.W wielu doświadczeniach wykazano,że w przypadku szczepionek przeciwwiru-sowych oraz przeciwbakteryjnych (TASCONi współaut. 1996), antygen białkowy stymu-Ryc. 2. Mapa wektora UC18.Plac, silny promotor; LacZ alpha, polilinker, oraz wy-kaz enzymów restrykcyjnych przecinaących polilin-ker; Ampicilin, gen oproności na ampicylinę.cyficzność wektora są sekwencje odpowie-dzialne za inicjację replikacji, tzw. sekwencjeori.Najprostsze wektory posiadały wyłączniejedno, unikalne miejsce restrykcyjne, w któremożna było wprowadzić obcy DNA. Obecnienajczęściej jest to tzw. Polilinker, tzw. synte-tyczny odcinek DNA, w którym znajduje sięzwykle kilkanaście miejsc rozpoznawanychprzez enzymy restrykcyjne. Pozwala to naswobodniejszy dobór odpowiedniego do klo-nowania enzymu. Wektory zazwyczaj posiada-ją również geny markerowe, czyli geny kodu-jące białka odpowiedzialne za łatwo wyróż-nialne cechy fenotypowe. Wektor musi byćtak skonstruowany, aby istniała możliwośćselekcji tych komórek, do których wniknął.Jego budowa powinna pozwalać także na od-różnienie wektora zrekombinowanego od ta-kiego, który zamknął się bez włączenia frag-mentu DNA. Taki konstrukt w odpowiedniejdawce, jest podawany do organizmu żywicie-la, gdzie nastepnie cDNA antygenu ulega eks-presji, a wydzielane białko spełnia rolę anty-genu. Ważnym elementem, w projektowaniuskutecznej szczepionki DNA jest zrozumieniezależności pomiędzy mechanizmami immuno-logicznymi żywiciela i pasożyta. SzczepienieDNA potrafi pobudzić odpowiedź immunolo-giczną Th1-zależną i Th2-zależną. OdpowiedźTh1, zależna charakteryzuje się produkcjąprzeciwciał IgG2 (IgG1 u ludzi) i aktywacjąmechanizmu odpowiedzi cytotoksycznychkomórek T. Odpowiedź Th2 — zależna zwią-zana jest z przeciwciałami IgM, IgG1 (IgG4u ludzi), IgA i odpowiedzą przeciwciał IgE.Jednakże, rezultat szczepienia często zależnyjest od kilku czynników.126LUIZAJEDLINA-PANASIUKluje głównie odpowiedź typu humoralnego(Th2 zależną), zaś szczepionka DNA wywo-łuje również odpowiedź typu komórkowego(Th1). Po śródskórnym podaniu szczepionkiw postaci wektora zawierającego cDNA ko-dujący określony antygen, obserwowano od-powiedź typu Th1, natomiast po wprowadze-niu tą samą drogą antygenu w postaci białka,odpowiedź typu Th2 (RAZi współaut. 1996).Pobudzenie odpowiedzi typu Th1 przy uży-ciu szczepionki DNA jest związane z wydzie-leniem przez komórki prezentujące antygeninterleukiny 12 (IL-12), która stymuluje pro-dukcję interferonu gamma (IFN-γ), kierujące-go odpowiedź w stronę Th-1 (RAZi współ-aut. 1996). W badaniach nad szczepionkąprzeciwko malarii ustalono, że podanie jakopierwszej dawki antygenu w formie cDNA,a kolejnej w formie rekombinowanego anty-genu białkowego może wywołać wyższy po-ziom odporności na zarażenie niż dwukrotnepodanie antygenu w tej samej formie (KOFTAi WĘDRYCHOWICZ2001).W przypadku szczepionek przeciwkoF. hepaticastwierdzono, że szczury immu-nizowane cDNA kodującym GST wykazywa-ły zmniejszenie liczby przywr w wątrobachszczepionych szczurów o 54% w porówna-niu z kontrolą zarażenia, natomiast szczury,którym podano antygen w formie rekombi-nowanego białka GST syntetyzowanego w ko-mórkach owadzich wykazywały nieco niższy(48% redukcja) poziom odporności na zara-żenie oraz inny profil i dynamikę odpowie-dzi przeciwiciał (WĘDRYCHOWICZi współaut.2002). Z kolei SMOOKERi współaut. (2001)wykazali, że katepsyna L podana w formiecDNA może wywoływać odpowiedź humo-ralną, która u myszy była znacznie niższa niżu owiec szczepionych białkową formą tegoenzymu.ilości (DAVISi wsp. 1995). KOFTAi współaut.(2000) uzyskali wysoki stopień odpornościprzeciwko inwazjiF. hepaticau szczurówszczepionych 50 μg cDNA proteinazy cyste-inowej z bupiwakainą. Mechanizm działa-nia szczepionki DNA zależny jest od drogipodania, rodzaju antygenu i dawki DNA.Szczepionki DNA można podawać w różnysposób, w zależności od typu wywołania po-trzebnej odpowiedzi immunologicznej.Wpływ drogi podania antygenu naodpowiedź immunologicznąIstnieje wiele dróg podawania szczepio-nek DNA (KOFTAi WĘDRYCHOWICZ2001), jaki białkowych. By wprowadzić szczepionkęDNA do organizmu stosuje się zwykłą iniek-cję, armatki genowe, aerozol, bądź kroplie donosa. Najprostszym i najstarszym sposobemjest iniekcja domięśniowa. W odniesieniu doszczepionek DNA jest to metoda dość wydaj-na, ponieważ tkanka mięśniowa ma szczegól-ną zdolność do wychwytywania DNA (DANKOi WOLFF1994). W przypadku mięśni szkiele-towych, przypuszcza się, że ważną rolę przy-czyniającą się do skuteczności i wydajnościekspresji, odgrywają komórki dendrytyczne,należące do komórek prezentujących antygen(ERLTi XIANG1996). Jednakże istnieją uzasad-nione obawy, że szczepienie domięśnioweprzeciwko pasożytom przewodu pokarmo-wego może być mało skuteczne ze względuna fakt, że domięśniowe podanie szczepion-ki wywołuje głównie systemową odpowiedźimmunologiczną, zaś w odporności przeciw-ko pasożytom jelitowym istotną rolę odgry-wa lokalna odpowiedź immunologiczna błonśluzowych. Stosuje się też kompleksy DNA--lipid, które w podaniu dożylnym wykazująwiększą ekspresję (produkcję antygenów),niż po podaniu domięśniowym. W ostatnimczasie zaczęto podawać DNA w formie aero-zolu i uznano, że najlepsze wyniki uzyskujesię przy wykorzystaniu tej metody do lecze-nia chorób dróg oddechowych. Zachęcającewyniki w wywoływaniu odporności przeciw-ko inwazjiAscaris suumuzyskano podającantygen szczepionkowy w formie cDNA nabłonę śluzową nosa myszy (TSUJIi współaut.2003). Również nasze wcześniejsze badanianad wykorzystaniem proteinazy cysteinowejdo uodpornienia żywicieli przeciwko inwazjiF. hepaticawykazały, że donosowe podaniecDNA tego enzymu wywołuje znaczącą od-porność szczurów na zarażenie metacerkaria-mi tej przywry (WĘDRYCHOWICZi współaut.2003). DNA można również podawać w for-Wpływ wielkości i liczby dawek antygenuna odpowiedź immunologicznąDo wywołania reakcji obronnej organi-zmu niezbędna jest odpowiednia dawka an-tygenu. W przypadku szczepienia DNA bar-dzo ważną rolę odgrywa też miejsce podaniakonstruktu wektor–cDNA antygenu. I tak naprzykład, podczas iniekcji domięśniowej sto-suje się standardowo 100 μg na małe zwie-rzę laboratoryjne (szczur, mysz) (XUi LIEW1994). Dodatkowo można wzmocnić pobie-ranie DNA antygenu, stosując domięśniowobupiwakainę. Środek ten uszkadza włóknamięśniowe, które po regeneracji pobierająz komórek satelitarnych wektor w większejSzczepioneki genetyczne przeciwko helmintom127Tabela 1. Przyklady prowadzonych badań nad szczepionkami cDNA przeciwko pasożytom.PasożytPlasmodium yoeliŻywicielMyszcDNAPyCSP, PyHEP17,PySSP2Siedem antyge-nów z różnychstadiów rozwojo-wych pasożytaSiedem antyge-nów z różnychstadiów rozwojo-wych pasożytaMetaloproteinazagp6326 kDa GSTWynikSilna odpowiedź limfocy-tów T CD8+Wysokie miano specyficz-nych przeciwciałLiteraturaHOFFMANi wpółaut. 1994,1997TINEi współaut. 1996Plasmodium falci-parumMałpaPlasmodium falci-parumNaczelnyBrak odpornościOCKENHOUSEi współaut.1998Leishmania majorMyszZmniejszenie uszkodzeń iilosci pasożytówOdpowiedź przeciwciał,brak odpornościXUi LIEW1994Schistosoma japo-nicumMyszYANGi współaut. 1995Schistosoma man-soniTaenia ovisMyszSm2363% odporności na uszko- HARNi współaut. 1998dzeniaRóżny poziom przeciwciał DREWi współaut. 2000MyszRóżne formy 45WKETc7Taenia crassicepsMyszOdporność: samice — 59% ROSASi współaut. 1998samce — 100%Fasciola hepaticaSzczurProteinaza cyste-inowaOdporność: samice — 74% KOFTAi współaut. 2000samce — 100%mie kulek złota mikroskopijnej wielkości,opłaszczonych antygenem (ang. gene gun).Pistolet genowy bardzo często jest używanyw pracach nad szczepionkami, wykorzystujeon sprężony hel do wstrzeliwania przez skó-rę żywiciela kuleczek złota o średnicy 1 mm,pokrytych cDNA antygenu. Po wstrzyknięciudostają się one bezpośrednio do cytosolu ko-mórek. Metoda ta, mimo że jest kosztowna,daje pomyślne wyniki szczepień już przy nie-wielkich ilościach antygenu.WYNIKI BADAŃ NAD SZCZEPIONKAMIPRZECIWKO PASOŻYTOMDo tej pory najwięcej badań przeprowa-dzono nad szczepionkami przeciwko inwa-zjom pierwotniaczym, w szczególności paso-żytom z rodzajuPlasmodium,orazLeishaniasp.(Tabela 1). Inwazje te są przyczyną wieluzgonów ludzi na świecie. Szczepiąc myszyDNA kodującym bialko gp63, pochodzącymodLeishmania major,a następnie zarażającje tym pasożytem, stwierdzono zmniejszenieuszkodzeń w porównaniu ze zwierzętami nieszczepionymi. COSTAi współaut. (1998) skon-struowali plazmid zawierający DNA kodującyenzym wydzielany przezTrypanosoma crusi.Myszy immunizowane tym konstruktem wy-kazywały znaczące zmniejszenie żywotnościtego pasożyta.Wcześniejsze, pozytywne próby nadszczepionkami DNA spowodowały, iż zosta-ły wykorzystane do poszukiwań skutecznejszczepionki przeciw inwazjom robaków, tj.Schistosomasp.,Ancylostomaspp. orazFa-sciola hepatica.Pierwsze szczepienie DNAprzeciw pasożytowi wielokomórkowemu wy-konano na myszy wektorem niosącym cDNA

zanotowane.pl

doc.pisz.pl

pdf.pisz.pl

hannaeva.xlx.pl