Zgryźliwość kojarzy mi się z radością, która źle skończyła.
Tegoroczni laureaci Nagrody Nobla Andrew Z. Fire i Craig C. Mello odkryli mechanizm o podstawowym znaczeniu dla regulacji przepływu informacji zawartej w genach. Informacje zakodowane w cząsteczkach DNA w jądrze komórkowym są przenoszone do cytoplazmy, gdzie syntetyzowane są białka. Transmisja kodu genetycznego jest możliwa dzięki tzw. informacyjnemu RNA (mRNA).
W 1998 r. Amerykanie Andrew Fire i Craig Mello opublikowali doniesienie o odkryciu mechanizmu umożliwiającego zniszczenie (degradację) mRNA niosącego informację z określonego genu. Ten mechanizm, który otrzymał nazwę interferencji RNA, zostaje uruchomiony, gdy w komórce pojawiają się nici RNA połączone ze sobą w pary. Dwuniciowy RNA aktywuje mechanizmy biologiczne, które niszczą cząsteczki mRNA niosące kod genetyczny identyczny z kodem dwuniciowego RNA. Zniknięcie takich cząsteczek mRNA jest równoznaczne z wyłączeniem (wyciszeniem) wysyłającego je genu, czyli zahamowaniem syntezy kodowanego przez ten gen białka.
Zjawisko interferencji RNA występuje w komórkach organizmów roślin, zwierząt i człowieka. Interferencja RNA ma duże znaczenie dla regulacji ekspresji genów, jest jednym z mechanizmów chroniących komórki przed zakażeniem wirusami, a także trzyma w karbach tzw. ruchome geny (transpozony). Już obecnie wykorzystuje się to zjawisko w badaniach funkcji genów, a w przyszłości interferencja RNA być może stanie się podstawą nowatorskich metod leczenia.
Przepływ informacji wewnątrz komórki: z DNA przez mRNA do białka
Kod genetyczny zawarty w cząsteczkach DNA określa budowę białek. Instrukcje zawarte w DNA są kopiowane do cząsteczek mRNA, a następnie wykorzystywane do syntezy białek (Ryc. 1). Brytyjski laureat Nagrody Nobla Francis Crick nazwał przepływ informacji genetycznej od DNA przez mRNA do białek podstawowym dogmatem biologii molekularnej. Białka uczestniczą we wszystkich procesach życiowych, na przykład jako enzymy trawiące pokarm, receptory odbierające sygnały w mózgu czy przeciwciała broniące nas przed bakteriami.
Genom człowieka składa się w przybliżeniu z 30 000 genów. Poszczególne komórki z tej puli wykorzystują bardzo małą liczbę genów. To, które geny ulegają ekspresji (tzn. są wykorzystywane do syntezy nowych białek), regulują mechanizmy nadzorujące proces transkrypcji, czyli kopiowania DNA do mRNA. Przebieg transkrypcji informacji genetycznej również zależy od różnych czynników. Najważniejsze zasady regulacji ekspresji genów odkryli ponad 40 lat temu laureaci Nagrody Nobla z Francji François Jacob i Jacques Monod. Dziś wiemy, że podobne zasady funkcjonują we wszystkich żywych organizmach - od bakterii do człowieka. Ich poznanie umożliwiło także opracowanie technik inżynierii genetycznej pozwalającej na wprowadzenie do komórki sekwencji DNA kodujących wytwarzanie nowych białek.
Na przełomie lat dziewięćdziesiątych poprzedniego stulecia biolodzy molekularni przeprowadzali eksperymenty dające trudne do wytłumaczenia wyniki. Najbardziej zaskakujące rezultaty uzyskiwano w doświadczeniach mających na celu zwiększenie intensywności barwy płatków petunii dzięki wprowadzeniu genu stymulującego tworzenie się czerwonego barwnika. Jednak zamiast bardziej intensywnego koloru obserwowano całkowitą utratę barwy: płatki stawały się białe! Mechanizm leżący u podłoża takich efektów pozostawał zagadką do czasu, gdy Fire i Mello dokonali odkrycia, które uhonorowano tegoroczną Nagrodą Nobla.
Odkrycie zjawiska interferencji RNA
Andrew Fire i Craig Mello badali regulację ekspresji genów u nicienia Caenorhabditis elegans (Ryc. 2). Badacze wstrzykiwali robakom cząsteczki mRNA kodujące jedno z białek mięśni, jednak nie wywoływało to zmian w zachowaniu nicieni. Sekwencje mRNA niosące informację genetyczną określa się jako "sensowne". Wstrzykiwanie "antysensownego" RNA, które może się wiązać z mRNA przez dopasowanie par zasad, również nie wywoływało zmian. Dopiero po wstrzyknięciu połączonych sekwencji sensownych i antysensownych badacze zaobserwowali, że nicienie dostawały drgawek. Podobne zaburzenia występowały u robaków, których DNA nie zawierało sprawnego genu odpowiedzialnego za wytwarzanie badanego białka. Jak to wytłumaczyć?
Sensowne i antysensowne sekwencje RNA łączą się, tworząc podwójną nić RNA. Czy dwuniciowa cząsteczka RNA może "wyciszać" gen kodujący tę samą informację genetyczną? Fire i Mello badali tę hipotezę, wstrzykując C. elegans dwuniciowe cząsteczki RNA kodujące kilkanaście innych białek nicieni. W każdym z tych eksperymentów wstrzyknięcie dwuniciowego RNA niosącego informację genetyczną prowadziło do ustania syntezy kodowanego białka, czyli wyciszenia genu zawierającego tę samą informację.
Po przeprowadzeniu cyklu prostych, lecz elegancko zaprojektowanych eksperymentów, badacze doszli do wniosku, że dwuniciowy RNA jest w stanie wyciszyć geny i że zjawisko interferencji RNA dotyczy genu o kodzie identycznym z kodem wstrzykniętych cząsteczek RNA. Stwierdzili także, że komórki mogą przekazywać interferencję RNA innym komórkom, a nawet komórkom potomnym. Ponieważ do wyciszenia genów wystarczało wstrzyknięcie niewielkich ilości dwuniciowego RNA, Fire i Mello doszli do wniosku, że interferencja RNA (obecnie powszechnie oznaczana skrótem RNAi) ma charakter katalityczny.
Badacze opublikowali wnioski z eksperymentów w "Nature" 19 lutego 1998 r. Ich odkrycie pozwoliło na wyjaśnienie wielu zagadkowych i wzajemnie sprzecznych obserwacji eksperymentalnych i ujawnienie stworzonego przez naturę mechanizmu regulacji przepływu informacji genetycznej. Oznaczało to otwarcie całkiem nowych możliwości badawczych.
Tajniki mechanizmu interferencji RNA
W ciągu kilku następnych lat wyjaśniono mechanizm zjawiska RNAi (Ryc. 3). Dwuniciowy RNA wiąże się z kompleksem białek o nazwie Dicer, który tnie nici na mniejsze fragmenty, które są następnie przyłączane do innego kompleksu białek, tzw. RISC. W tym procesie jedna z nici ulega eliminacji, ale druga po przyłączeniu do kompleksu RISC jest wykorzystywana do rozpoznawania cząsteczek mRNA. Cząsteczki mRNA łączące się z fragmentem RNA związanym z RISC zostają także przyłączone przez RISC, pocięte na fragmenty i zniszczone w procesie degradacji. W ten sposób dochodzi do wyciszenia genu obsługiwanego przez ten rodzaj mRNA.
Interferencja RNA chroni przed wirusami i ruchomymi genami
Interferencja RNA ma znaczenie dla ochrony organizmu przed wirusami, zwłaszcza u organizmów niższych. Dwuniciowy RNA jest częścią kodu genetycznego wielu wirusów. Gdy jeden z takich wirusów zakaża komórkę, wstrzykuje wytwarzaną przez siebie cząsteczkę RNA, która natychmiast wiąże się z kompleksem Dicer (Ryc. 4A). Dochodzi do aktywacji kompleksu RISC i degradacji wirusowego RNA, dzięki czemu komórka jest w stanie poradzić sobie z zakażeniem. U wyższych organizmów istnieją także inne mechanizmy obrony, takie jak wytwarzanie przeciwciał, komórek cytotoksycznych i interferonów.
Ruchome geny, nazywane także transpozonami, to sekwencje DNA, które mogą się swobodnie przemieszczać w obrębie genomu. Transpozony występują w komórkach wszystkich żywych organizmów i mogą powodować ich uszkodzenia, jeżeli znajdą się tam, gdzie nie powinno ich być. Wiele transpozonów powiela się dzięki wykorzystaniu kopiowania DNA do RNA. Cząsteczki RNA są następnie z powrotem zamieniane w DNA, który zostaje umieszczony w innym miejscu genomu. Fragmenty takich cząsteczek RNA mają często postać podwójnych nici, dzięki czemu interferencja RNA może je unieszkodliwiać, chroniąc genom organizmu przed transpozonami.
Interferencja RNA reguluje ekspresję genów
Interferencję RNA można wykorzystać do regulacji ekspresji genów nie tylko robaków, ale także człowieka (Ryc. 4B). W genomie człowieka istnieją setki genów kodujących niewielkie cząsteczki RNA, tzw. microRNA, które zawierają fragmenty kodu innych genów. Cząsteczki microRNA mogą tworzyć struktury dwuniciowe, aktywując tym samym mechanizmy interferencji RNA, czego wynikiem jest zahamowanie syntezy białek, czyli wyciszenie określonego genu. Obecnie wiadomo już, że procesy regulacyjne, w których biorą udział cząsteczki microRNA, mają duże znaczenie dla rozwoju organizmu i regulacji czynności różnych składników komórki.
Nowe możliwości w badaniach biomedycznych technologii genowej i służbie zdrowia
Interferencja RNA otwiera nowe perspektywy dla tzw. technologii genowych. Opracowano dwuniciowe cząsteczki RNA służące do wyciszania określonych genów u ludzi, zwierząt lub roślin (Ryc. 4C). Po wprowadzeniu do wnętrza komórek takie cząsteczki aktywują proces interferencji RNA prowadzący do degradacji mRNA niosącego identyczny kod genetyczny.
Metoda interferencji RNA stała się znaczącą metodą badawczą w biologii i biomedycynie. Jest nadzieja, że w przyszłości zakres zastosowań tej metody obejmie wiele innych dziedzin, w tym medycynę i rolnictwo.
Kilkanaście opublikowanych w ostatnim okresie prac opisuje udane wyciszenie genów w komórkach organizmu człowieka i u zwierząt eksperymentalnych. Na przykład dzięki podaniu zwierzętom odpowiednio spreparowanego RNA udało się wyciszyć gen związany z wysokim stężeniem cholesterolu we krwi. Plany na przyszłość obejmują opracowanie molekularnych wyciszaczy do stosowania w leczeniu zakażeń wirusowych, chorób układu krążenia, nowotworów, zaburzeń hormonalnych i niektórych innych chorób.